表皮干细胞培养
表皮干细胞
表皮干细胞表皮干细胞强的潜在增生特点，它的自我修复能力可以保持体内平衡和表皮再生。
在美容，药理学，再生医学，烧伤中有非常重要的作用。
表皮干细胞( epidermal stem cell) 为组织特异性干细胞，在胚胎期主要集中于初级表皮嵴，至成人时呈片状分布在表皮基底层。
表皮干细胞的分化潜能有限，只能定向分化为角质细胞、毛发及皮脂腺。
表皮干细胞典型特征有: (1)自我更新能力, 体外培养时呈克隆性生长，可分裂140 次，产生1X1040 个子细胞；(2)慢周期性，表现为活体细胞标记滞留；(3)对皮肤基底膜的黏附, 干细胞主要通过整合素实现对基底膜的黏附，是干细胞维持特征的基本条件。
诱导表皮干细胞分化的因素有表皮细胞生长因子( EGF) 、纤维母细胞生长因子( FGF) 及ß- 连环蛋白等。
表皮干细胞的研究，目前仍处于实验观察阶段，但已展示了良好的临床应用前景。
表皮干细胞包括多种类型毛囊干细胞、毛囊间表皮干细胞、皮脂腺前体细胞以及峡部干细胞。
其中位于毛囊隆突部位的毛囊干细胞目前研究的最为清楚，它对于维持毛囊组织稳态以及皮肤创伤愈合十分重要；毛囊间表皮干细胞位于表皮基底层，虽然目前还没有足够明确的标记物将其准确定位，但它对于维持动物无毛部位以及人类表皮组织稳态发挥着作用；皮脂腺干细胞或前体细胞是另一类表皮干细胞，它独立于毛囊干细胞而存在，在维持皮脂腺组织稳态过程中发挥作用。
表皮干细胞的标记物目前一些细胞表面糖蛋白，如整合素、核蛋白P63、角蛋白等已被作为表皮干细胞的特异性标记物而受到关注整合素：整合素为一类位于细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，这类分子主要介导细胞与细胞外基质的黏附。
整合素包含α和β两种亚型。
通过α6和CD71可以将基底细胞分为3种类型：α6briCD71bri细胞占总数的(58.6±8.2)%，主要是短暂扩增细胞；α6briCD71dim细胞占总数的(8.1±2.0)%，代表干细胞；α6dim细胞占总数的(15.1±2.5)%，代表终末分化细胞。
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定何黎顾华昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南[摘要]目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。
方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。
结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。
结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。
[关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。
随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。
人工皮肤的研制就是一个典型例子。
在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。
为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。
材料和方法一、材料1、取材选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。
2、主要培养基及试剂(1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。
二、方法1、取材将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。
表皮干细胞体外诱导转分化为角膜上皮细胞的实验研究
文章编号:1000-5404(2006)07-0671-03论著表皮干细胞体外诱导转分化为角膜上皮细胞的实验研究杨珂,余瑾,杨恬(第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室,重庆400038)提要:目的探讨表皮干细胞向角膜上皮细胞转分化的可塑性。
方法用Ⅳ型胶原筛选的方法培养并鉴定表皮干细胞,经体外与角膜缘基质细胞共培养诱导分化,免疫组化检测角膜上皮细胞特异标志物K12表达。
结果获得的表皮干细胞表现出很强的增殖潜能,光镜下为原始细胞形态特征,能强表达K19和B1-i ntegr i n,共培养2周后可见细胞分化,细胞表达角膜上皮特征性K12。
结论在本实验的体外诱导条件下,表皮干细胞能转分化为角膜上皮细胞。
关键词:表皮干细胞;角膜上皮;转分化中图法分类号:R322.91;R329.21;R329.24文献标识码:ATransdifferenti ati on of epi der mal ste m cells i nto corneal epitheli al cells i n vitro YANG K e,YU Jin,YANG T ian(D epart m ent of Ce ll Bio l ogy,Co llege o f M ed i c i ne,T hird M ilitary M ed i ca l U n i versity,Chongq i ng 400038,Ch i na)Abstract:Obj e cti v e To exp l o re the p lasticity of transd ifferenti a ti o n of epider m al ste m ce lls(ESC s)into cornea l epithelia l cells.M ethods Epider m a l ste m cells enriched by adhering to typeⅣco llage w ere induced in vitro by coculture w ith corneal stro m a l fi b roblasts.The m ethod o fHCC w ere used to sho w t h e expressi o n of K12w hich is expressed spec iall y i n cornea l epithelial cells.Results ESCs w it h greater pro liferati o n po tentia l strong ly expressed K19and B1-i n tegrin.A fter t w o-w eek induction,the K12positive cells could be de tected.Concl u si o n The data suggested that the epider m a l ste m ce lls have the po tentia l to transdifferentiate into corne-al ep ithelial cells in vitro.K ey w ords:ep i d er m a l ste m ce lls;cor neal epithe li a l ce lls;transdifferentiation角膜是眼球与外界接触的主要部分,容易遭受外界因素的侵袭而被破坏,从而使眼球丧失正常的感光功能。
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细胞条件 培养基，对人表皮干细胞成功进行 了体外 分离和培养 。
关键词 ：表 皮干细胞；体外 ；分离 ；培养
中图分类 号： ３ ４ 文献标识码： Ｒ ９． ２ Ａ
文 章 编 号 ：１７ —２ ５２ ０ ）３０ ５ ７０ ６ ３８ ２ （０ ８４ —８ ９ —４
主要观察指标 ：传 至第 ２ 代，通过平板 克隆
．
形成实验计算 克隆形成率和克隆维持 时间， 采用免疫组织化 学染色检测 Ｂ １整合素和角 蛋白 １ ９的表达 。
曾元临 ，辛国华，邱 泽亮 ． 人表皮 干细胞 的体 外分 离和 培养 ｆ ． 国组 织工程 研 究与 临床 Ｊ中 １ 康 复 ，２ ０ ， ｌ （３：５ ７８ ０ ０ ８ ２４ ） ９ —６ ０ ８
； Ｒ ｗｇｆｍ 乏 ｗ ．ｃｃ Ｉ ｗｚｋｏ ￣ ｌ
ＺｇＬｔ． ｒｓｔ ｄｕｒｆｕｎｐ—ａ——— ｅ ， Ｉ ｉ ｉａｎｎｃｕｏ ｍ ｉｍ ｍｅ ｎＹ ｅ１ ｖｏｏｉ ａ ｌｅ ａｅｅ—ｔ —— ａｎｔ ｌ ｏ ｔ ｈ ｄ —ｅｃｓ ｒｌ— ｌ —ｓ — ｌ
人表 皮干细胞 的体外分离和培养
白酶两 步法分离出角朊细胞和成 纤维细胞， Ⅳ型胶 原快速黏附法富集分离表 皮干 细胞。
收集处 于指 数生长期第二三代成 纤维 细胞的 上清液 ，过 滤后与角朊细胞无血清培养 基等 比例混 合，并加入胎牛血清 、 表皮 生长 因子、 牛垂体提取 物等组成表皮干细胞培养 液，用 以人表皮干细 胞的体外扩增培养 ，以角朊细
曾元临 ，辛 国华 泽亮 ，邱 （ 南昌大学第一附属 医院烧伤科 ，江西省 南昌市 ３００ ； 丽水市人 民医院Ｉｕ，浙江省 丽水市 ３０ ６ ｃ ３３０） ２００
曾元临 ，男，１６ ９ ４年生 ，江西省赣 州市人， 汉族 ，１８ 年 江西 医学院毕业，教授 ，主任 ９６ 医师 ，主要从 事创 面修复方面的研究
表皮干细胞的分选鉴定及培养
ｓｂｌ ｙ ｆ ｒｓ ｒ ｅ ｎ ｆ ｔｓ ｕ － ｎ ｎｅ ｒ ｄ ｉ ｕｓ ｒａ ｅ ｄ ｃ ｌｓ ｉ ｅ ｗａ ｏ ｃ ｅ ｎｉｇ ｏ ｉ ｓ ｅ ｅ ｇｉ ｅ ｅ ｎｄ ｔｉ ｌｓ ｅ ｅｌ ．Ｈ ｏ ｅ ｅ ａ ｆ ｔ ｒｓ ｕｄ ｓ ｎ ｅ ｄ ｔ ｂｔ ｉ ｇ ｗ ｖ ｒ， ｕｒｈｅ ｔ ｙ ｉ ｅ ｄｅ Ｏ ｏ ａｎ ｈｉｈ ｐｕｒｔ ｉｙ ＥＳＣ．
（ ｐ ｒ ｎ Ｄ ｒ ａ ｏｏ ｙ， ａ ｉ ｇ Ｈｏ ｐ ｔ ｌ Ｔ ｉｄＭｉ ｔ ｒ ｅ ｉ ｌ ｎ ｖ ｒｉ ， ｈ ｎ ｑｎ ０ ０ ２ Ｃ ｉａ Ｄｅ ａ ｔ ｔ ｆ ｅ ｍ ｔｌｇ Ｄ ｐ ｎ ｓ ｉ ， ｈ ｒ ｍｅ ｏ ａ ｌ ａ ｙＭ ｄ ｃ ｉｅ ｓ ｙ Ｃ ｏ ｇ ｉ ｇ ４ ０ ４ ， ｈｎ ） ｉ ａ Ｕ ｔ
ｔｇ ｉ ＯＫ１ ｓ２ ． ０ ｏ ｏ Ｃ ｎ ｌｓｏ Ｔｙ ｅＩ ｏｌｇ ｎａ ｈ ｓｖ ｎ ｓ ｃｅ ｎｎ Ｃ ｎｙａｐ ｉ ｒ ｔｐｂ ｔ ｈ ｓ ｅ — ｅ ｒ ｔ ｗａ ８ ５ ｎ ９ ｒｓ ． ｏ ｃｕ ｉｎ ｐ ｃ ｌ ｅ ｄ ｅｉｅ ｅｓｓｒ ｅ ｉｇＥＳ ｉ ｏ ｌ ｒｍａ ｙｓｅ ｕ ｅｍｏ ｔ ａ Ｖ ａ ｓ ｔ ｌ
法 ， 要 获 取 高纯 度 的 Ｅ Ｃ 需要 进 一 步 的 深 入 研 究 。 但 Ｓ
关键词 ： 型胶原 ； Ｖ Ｉ 表皮 干 细胞 ； 选 ； 定 分 鉴 中图分类号 ：４６８ Ｒ ４． 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ １８ ４ （０ ８ ０ —２ ５０ １ ７－３ ８ ２ ０ ） ３０ ７ —３
大鼠表皮基底层干细胞体外分离与培养
关键词 ： 成 体 干 细胞 ； 细胞培养技 术； 表 皮 干 细胞 ； 基 底 层 干 细胞
ｄ ｏ ｉ ： ｌ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ １ — ８ ３ ４ ８ ． ２ ０ １ ３ ． ２ １ ． 。 ０ １ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ １ － ８ ３ ４ ８ （ ２ ０ １ ３ ） ２ １ — ２ ４ ４ １ － ０ ３
ｎ ａ ｔ ａ ｌ ｒ ａ ｔ ｓ ｋ ｉ ｎ ｂ ａ ｓ ａ ｌ ｌ ａ ｙ ｅ ｒ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔｈ ｅ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｉ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｗｉ ｃ ｅ ｔ ｒ ｙ ｐ ｓ ｉ ｎ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏ ｒ ｍ ｎ ｅ ｏ ｎ ａ ｔ ａ ｌ ｒ ａ ｔ ｓ ｋ ｉ ｎ ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｗｅ
烧伤 与 复合 伤 国家重 点 实验 室 ， 重庆 ４ ０ ０ ０ ４ ２ ）
摘 要 ： 目的 建 立 简单 、 可 靠 的 大 鼠表 皮 基 底 层 干 细 胞 体 外 分 离培 养 方 法 。方 法 取 新 生 大 鼠 背部 皮 肤 ， 采用胰酶 两步 消 化 法 获 得 单 细胞 悬 液 ， Ⅳ型 胶 原 差速 贴 壁 法 富 集 干 细 胞 ， 将 慢 黏 附细 胞 作 为 对 照 组 细 胞 ， 均 以角质形成 细胞无 血清培 养基培 养。 以ｐ ｌ 一 整 合素和角蛋 白 ｌ ９ （ Ｋ１ ９ ） 双 重 荧光 染 色鉴 定 细 胞 表 型 ， 克 隆 形 成 实验 检 测 细 胞 体 外 增 殖 能力 。结 果 分 离培 养 的 细胞 为 多
ERK信号通路对人表皮干细胞增殖分化的影响
ERK信号通路对人表皮干细胞增殖分化的影响李冰;王军爱【摘要】背景：表皮干细胞体外培养时易于分化和衰老，增殖能力有限，制约了其在皮肤组织工程的应用和发展，了解表皮干细胞增殖分化的调控机制可以为表皮干细胞的临床应用奠定理论基础。
<br> 目的：探索ERK信号通路在人表皮干细胞增殖分化中的作用。
<br> 方法：分离培养表皮干细胞，使用ERK通路抑制剂PD98059抑制表皮干细胞ERK通路的活性，转染MEK1重组质粒过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路。
通过MTT法检测表皮干细胞的增殖率，克隆形成实验检测表皮干细胞的克隆形成能力，Western blot检测表皮干细胞标志蛋白K19和β1-整合素及分化细胞标志蛋白K10的表达。
<br> 结果与结论：①使用PD98059抑制ERK通路后，表皮干细胞增殖率下降，克隆形成减少，细胞分化加强；②过表达MEK1或者使用PMA激活ERK通路后，表皮干细胞增殖率上升，克隆形成能力增强，细胞分化受到抑制；③这些结果表明ERK通路在表皮干细胞的增殖分化中有重要的作用。
%BACKGROUND:Epidermal stem cel s (ESCs) cultured in vitro can easily become differentiated and aged, but have limited proliferation ability. These characters limit the application and development of ESCs in skin tissue engineering. Increasing understanding of the regulatory mechanism of ESCs proliferation and differentiation would lay the theoretical foundation for the clinical application of ESCs.<br> OBJECTIVE:To identify the role of the ERK pathway in the proliferation and differentiation of ESCs. <br> METHODS:ESCs were isolated and cultured in vitro. The activity of the ERK pathway was blocked by PD98059 and the activation of the ERK pathway was conducted by PMAor transfecting MEK1 recombinant plasmid to enable the overexpression of MEK1. The effect of activation or blockage of the ERK pathway on the proliferation and colony formation ability of ESCs was detected by MTT and colony formation assay, respectively. The expression of ESCs markers K19 andβ1-integrin and differentiated cel marker K10 was detected by western blot. <br> RESULTS AND CONCLUSION:When the activity of the ERK pathway was blocked by PD98059, the proliferation and colony formation abilities of ESCs were inhibited and the differentiation was enhanced. On the contrary, activating the ERK pathway by PMA or upregulation of MEK1 enhanced the proliferation and colony formation abilities of ESCs but inhibited the cel differentiation. These results indicate that the ERK pathway plays an important role in the proliferation and differentiation of ESCs.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2016(020)045【总页数】7页(P6807-6813)【关键词】干细胞;分化;表皮干细胞;MAPK;ERK;增殖;克隆形成;国家自然科学基金【作者】李冰;王军爱【作者单位】解放军第451医院皮肤科，陕西省西安市 710054;69027部队医务室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830002【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：表皮干细胞：是能够产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞，具有终身、无限的自我更新能力。
人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建
［］ 晓 光 ， 勇 ， 敏 ， ． 核 巨噬 细 胞 集 落 刺 激 因子 对 人 皮肤 成 纤 ９李 方 姚 等 单 维 细 胞 增 殖 和 胶 原 合 成 的 影 响 ［ ＿中 国 美 容 医 学 ， ０ ０ｌ（） Ｊ 】 ２ １，９８：
ｌ ４ 一 ｌ １ １９ ｌ５ ．
【ＯＬ ｂ ｅ Ｃ ｍｐｒ ｏ ｆｈ Ｄ ａ ｄＭＴ ｓａｓｆｒ ｕｎｉ ｉｇ ｌ ］ｏ ｎｒ Ｄ． ｏ ａｉ ｎｏ ｔｅＬ Ｈ ｎ Ｔ ａｓｙ ａｔｙｎ ｓ ｏｑ ｆ
应用改 良的酶 消化法 （ 良法） 改 及传统酶消化法 （ 传统 法） 离、 养 ｈ Ｓ ｓ倒 置显微镜观察 细胞形 态，Ｔ 分 培 ＥＣ ， Ｍ Ｔ法绘制 生长 曲线 、 免 疫组化 法测定 ｈ Ｓ ｓ Ｅ Ｃ 标志物 角蛋 白 １ （ １ ） Ｄ ９ Ｋ 和 整合素的表达 ， ９ 并且进一步比较 上述 两种方法所获种子 细胞构建的组织工程 皮肤 的形 态学的特 性。 结果 ： 台盼蓝 染色显示改 良法细胞 消化分 离教为 ９ ． ±１ ． １ ， ２２ ５ ６ 个 传统 法细胞消化分 离数为 ６ ． ± ５ ８５ ０ ２． １ （＜． １ ； 艮法活细胞 比率是 （４±０ ０ ） ， ６ ９ 个 Ｐ ＯＯ ）改 ９ ． １％ 传统法活 细胞 比率是 （５±０ ０ ） （ ＜． ５ 在 ８天时改 良法细胞 Ｍ Ｔ ７ ．４％Ｐ００ ） Ｔ 法 ０ 值 为 １ ３ ０传统 法为 Ｏ ７ ９ 改 良法较传统法活力好 ， Ｄ ＿０ ， ．７ ， 增殖快； 细胞免 疫组 织化学染 色显 示表 皮干细胞标志物 角蛋 白 １ ９
ｃｌ ｄａｈ ａｉｉ ｒｎ ｕｏ ａ ａｏ ｔｓ ［】 ＪＮｅ ｒｓｉＭｅ， ｅｌ ｅｔ：ｖ ｌ ｔ ｆ ｅ ｒｎ ｌ ｐ ｐｏｉ Ｊｌ ｕｏｃ ｄｙｏ ｓ ｔ
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2.2.
3. 人表皮干细胞的分离和培养
2.2.
3.1 原代培养
第1天：
①将包皮放入PBS（含4% PS）清洗两次，在解剖镜下剪去皮下脂肪组织；
②PBS（含4% PS）清洗三次
③将剪好的包皮放入空皿，用棉球沾取碘酒将包皮上下涂拭，立即放入70%
乙醇2道去碘，再用PBS（含4% PS）三道去乙醇；
④将包皮剪成2 cm*0.5 cm条状，表皮面朝上于4℃ 2 U/mL Dispase II消化12～
14 hr。
第2天：
①在解剖镜下用尖镊分离表皮与真皮，取下表皮并放入PBS 清洗；
②将表皮放入0.25% Trypsin/0.05% EDTA中，用弯剪将表皮剪碎，放置37℃
消化10～15 min；
③用37℃预热的DMEM（20% FBS）中止消化，轻缓吹散细胞；
④100目细胞筛过滤细胞液；
⑤取过滤后的细胞液到15 mL离心管，常温100g 离心5 min；
⑥弃上清，用KSFM 轻缓重悬细胞沉淀，接种于6 cm 培养皿，置37℃5%CO2 培养箱培养。
第3天：
①吸弃上清，加入新鲜KFSM；
②之后隔天半量换液，当细胞密度为50%以上时每天换液，至80%时传代[75]。
2.2.
3.2 人表皮干细胞的传代
①吸弃细胞的上清液；
②加入3 mL 0.05% Trypsin/0.02% EDTA，稍微荡后，吸弃上清，加入1mL 新
鲜0.05% Trypsin/0.05% EDTA，室温8～10 min，显微镜观察；
③细胞变圆时，加入10 mL预热的DMEM（20% FBS），终止消化，缓慢吹打
细胞；
④吸入15 mL EP 管，再用新鲜DMEM（20% FBS）荡洗培养皿，合并液体；
⑤室温100 g 离心 5 min，弃上清；
⑥加入4 mL新鲜KSFM 重悬细胞；
⑦将细胞液稀释到2.5 * 103
cells/cm2
，置37℃5%CO2培养箱培养；2.2.3. 人表皮干细胞的分离和培养
2.2.
3.1 原代培养
第1天：
①将包皮放入PBS（含4% PS）清洗两次，在解剖镜下剪去皮下脂肪组织；
②PBS（含4% PS）清洗三次；。