分子生物学实验技术(核酸的凝胶电泳) PPT课件
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第九讲凝胶电泳技术ppt幻灯片
3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离
不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量 的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度 是不一样的,超螺旋DNA移动快,而线状双链DNA移动要 慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA 带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其 他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用 同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出 现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
4、 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电
压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量 的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大, 因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压 增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大 于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得 超过5v/cm。
电泳槽
梳子
制胶板
负极电 源插孔
正极电
源插孔 电泳槽
电泳仪 电泳槽
电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型 ①分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子 迁移率要快； ②同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比 线性DNA分子要快，线性DNA分子比开环DNA分子 要快。
图2 线性DNA电泳图
第一节 凝胶电泳技术
凝胶电泳（Gel electrophoresis） 是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、
形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。 但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、 DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。
一、核酸的凝胶电泳
Separation Range Vs. % Agarose
分子生物学课件PCR
70℃
60 核苷酸/S/酶分子
55℃
24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行
延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃。
反应时间，可据扩增片段的长度而定：
◆ 一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够。
◆ 3～4kb的靶序列需3～4min；
◆ 10Kb需延伸至15min
2. 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点， 用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段， 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还 能进行变异性研究。
3. 分子杂交：如Southern印迹杂交：在两引物之间 另合成一条寡核苷酸链，标记后做探针，与PCR产 物杂交。此法既可作特异性鉴定，还可知其分子量。
第3轮扩增
PCR循环过程
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量 呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但 在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期， 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产 物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增 加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞 效应”，这种效应期称平台期。大多数情况下， 平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增体系
模A 5’
TaqDNA聚合酶
引物—— 5’ATCCGGAC
Mg2+
dGTP dTTP dATP 底物 dCTP
PCR 反应体系
PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
成功、产物条带位置及大小
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肿瘤标志物
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
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目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
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目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
分子生物学实验技术(核酸的凝胶电泳) ppt课件
1 不能有效的回收大片段DNA
2 不能有效回收少量DNA
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27
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳
polyacrylamide gel electrophoresis PAGE
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28
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29
（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质
在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯 基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。
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3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200， 研究证实900夹角也非常有效的。
4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行， PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳 动较快；但是较高的温度也引起较小片段 的泳动截留和明显的条带变宽。
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42
7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE
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14
TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液。三者相比：
1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化；
2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；
3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；
垂直交变电场系统
A-
B-
A+B
+A B-
场翻转系统
-
+B
+A
箝位匀转胶系统
40
（三） 影响分辨率的因素
1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。
基因工程的主要技术与原理-核酸分离 电泳ppt课件
操作者防护：实验过程中必须带手套，并常换手套， 尽量避免外源RNase的污染；
内源RNase：采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质 变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。
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29
（二）RNA的抽提和纯化
1) 酚-异硫氰酸胍抽提法：
异硫氰酸胍(GIT)与b-巯基乙醇共同作用可抑制 RNase活性；
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31
（三）mRNA的纯化
Northe亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3‘端的 poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开 发出许多用于mRNA纯化的层析柱。
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32
28S rRNA 18S rRNA
溶解备用 适度干燥；
37℃处理30min；
消化RNA
16.琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃贮存备用。
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25
开环螺旋 线状分子
超螺旋
质粒DNA电泳结果
1.共价闭合环状超螺旋(covalently closed circular DNA, ccc-DNA)
2.线状DNA(linear DNA, l-DNA)
RNA电泳结果
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33
三、核酸的评价
1.核酸纯度评价：
DNA样品： OD260/OD280=1.8 较纯； OD260/OD280>1.8 可能有RNA污染； OD260/OD280<1.8 有蛋白质污染；
RNA样品：
OD260/OD280=2.0 较纯；
OD260/OD280>2.0 可能有异硫氰酸残存 ；
5)将上清液转入另一离心管，加入等体积 异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰 浴20-30 min，沉淀DNA；
内源RNase：采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质 变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。
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（二）RNA的抽提和纯化
1) 酚-异硫氰酸胍抽提法：
异硫氰酸胍(GIT)与b-巯基乙醇共同作用可抑制 RNase活性；
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（三）mRNA的纯化
Northe亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3‘端的 poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开 发出许多用于mRNA纯化的层析柱。
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32
28S rRNA 18S rRNA
溶解备用 适度干燥；
37℃处理30min；
消化RNA
16.琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃贮存备用。
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开环螺旋 线状分子
超螺旋
质粒DNA电泳结果
1.共价闭合环状超螺旋(covalently closed circular DNA, ccc-DNA)
2.线状DNA(linear DNA, l-DNA)
RNA电泳结果
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三、核酸的评价
1.核酸纯度评价：
DNA样品： OD260/OD280=1.8 较纯； OD260/OD280>1.8 可能有RNA污染； OD260/OD280<1.8 有蛋白质污染；
RNA样品：
OD260/OD280=2.0 较纯；
OD260/OD280>2.0 可能有异硫氰酸残存 ；
5)将上清液转入另一离心管，加入等体积 异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰 浴20-30 min，沉淀DNA；
分子生物学检验技术核酸的基本结构和功能ppt课件
HOCH2 O OH HH
H
H
OH OH
D-核 糖
Ribose
HOCH2 O OH HH
H
H
OH H
D-2-脱 氧 核 糖
Deoxyribose
2. 碱基
⑴. 嘌呤（Purine） --------两个环
腺嘌呤Adenine
NH 2
N N
N H
N
A
7
6
5
1
8
9
4
2
3
鸟嘌呤guanine
O
N NH
N H
以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴
化乙锭（EB），在紫外下发 出荧光
三、核酸的变性、复性与分子杂交
1. 变性
稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链 结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。
变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收 增加（增色效应）
HH
H
H
H
HH
HH
H
OH OH
OH OH
OH OH
OH OH
腺嘌呤核苷 鸟嘌呤核苷
胞嘧啶核苷 尿嘧啶核苷
Adenosine Guanosine Cytidine Uridine
假尿苷（ψ）
次黄苷（肌苷）I
黄嘌呤核苷 X
5
二氢尿嘧啶核苷 D
取代核苷的表示方式
OH
7-甲基鸟苷 m5G
六、核苷和磷酸怎样连接成核苷酸？
GMP
七、核苷酸与核苷酸怎样连接成核酸？
上一个核苷酸的C3’-OH 与下一个核苷酸的5’-磷 酸基形成3’,5’-磷酸二酯键
DNA的琼脂糖凝胶电泳资料ppt课件
2）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直 接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便 于定量测定。
3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进 行电泳。
琼脂糖凝胶电泳的应用
用于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等的电泳分 离。现广泛应用于核酸的研究中。
按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，是分析 鉴定基因工程重组DNA 分子的重要实验手段。
是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA核苷酸 序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础，受到科 学界的高度重视。
二、试剂与器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
试剂
1、Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取 10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水， 定容至1000mL。
图像的实时观测
三、操作方法
1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧 瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯， 加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂 糖。
注意 要完全融化混匀
2、凝胶板的制备
置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水
平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表
四、实验结果
打印凝胶电泳图，贴于实验报告上，并对实 验结果进行讨论，分析所测未知DNA的大小。
五、课后研讨题
1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 2、实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅
资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 3、查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应
用和发展。
3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进 行电泳。
琼脂糖凝胶电泳的应用
用于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等的电泳分 离。现广泛应用于核酸的研究中。
按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，是分析 鉴定基因工程重组DNA 分子的重要实验手段。
是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA核苷酸 序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础，受到科 学界的高度重视。
二、试剂与器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
试剂
1、Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取 10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水， 定容至1000mL。
图像的实时观测
三、操作方法
1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧 瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯， 加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂 糖。
注意 要完全融化混匀
2、凝胶板的制备
置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水
平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表
四、实验结果
打印凝胶电泳图，贴于实验报告上，并对实 验结果进行讨论，分析所测未知DNA的大小。
五、课后研讨题
1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 2、实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅
资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 3、查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应
用和发展。
《核酸电泳》PPT课件
解决方案
提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA 设计在3'端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度
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24
RT常见问题分析和解决方案
问题三：产生弥散（smear）条带
可能原因
解决方案
第一链产物的含量过高 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增
40
凝胶电泳的原理：
当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极。 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。
它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。 也就是说电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也 就越快。反之则较慢。
电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。 由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚 丙烯酰胺凝胶等, 降低了对流运动．故已知摩擦系数是分子的大小、极性及介 质粘度的函数．因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异。以及所带的 净电荷的多寡。便可以通过电泳将蛋白质或核园分子混合初中的各种成分被 此分离开来。
人们采用各种材料作为支持电泳介质．创造出许多新方 法．其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳 最为突出。
自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以 来．按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术．已经发 展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相 互作用的重要实验手段．
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39
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变性电泳条带变淡：
➢ EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量， 变性电泳比非变性电泳要淡一些；
➢ 甲醛的质量不高 。
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核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。其基本原理是利用核酸分子在电场中的迁移行为，通过特定的支持介质如琼脂糖凝胶，实现不同分子量或构型的核酸分子的分离。琼脂糖凝胶电泳中，凝胶的制备、电泳条件、DNA迁移速率的影响因素等是关键技术点。DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA构象、溴化乙锭的插入等都会影响迁移速率。此外，电泳缓冲液的选择也至关重要，常用的有TAE、TPE和TBE，它Байду номын сангаас在缓冲容量、DNA迁移速率和分辨率方面存在差异。凝胶载样缓冲液则用于增加样品密度、提供颜色标记和预测泳动速率。最后，通过染色法如EB染色和SYBR Gold染色，可以在紫外灯下检测DNA片段。这些技术细节和操作方法对于准确进行核酸电泳实验并获取可靠结果具有重要意义。