克隆载体表达载体构建详细版
表达载体的构建
中国海洋大学 科学馆319 （4）设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。
谢 谢
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1. 尽可能除去无关的DNA序列 从而增加载体容量。 2. 选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方 便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合 表达，融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对 转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 3. 选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建 重组子进行酶切时会把靶基因给切开。 4. 在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密 码子
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二 构建表达载体的基本步骤
引物设计
目的基因(CDS区）的克隆
目的基因进行酶切
质粒进行酶切线性化，电泳，胶回收纯化
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模板与线性化质粒连接
转化到大肠杆菌DH5α
鉴 定（PCR,测序,酶切）
将表达载体导入表达菌株
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三 载体构建具体范例：
大菱鲆GHR基因构建入pEGFP载体中
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1. GHR从大菱鲆cDNA模板中扩增
5‘非翻译区
CDS区 内引物
3‘非翻译区
初次PCR引物设计（外引物）
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2. 分析酶切GHR基因酶切位点
将GHR基因mRNA序列的CDS区（蛋白编码区）导入
DNAMAN 软件中，进行酶切位点分析：
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3. 引物的设计
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
构建基因表达载体的流程
构建基因表达载体的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!Download Tip: This document has been carefully written by the editor.I hope that after you download, they can help you solve practical problems. After downloading, the document can be customized and modified. Please adjust and use it according to actual needs. Thank you!构建基因表达载体的流程：①目的基因选择与克隆：确定需要表达的基因序列，通过PCR扩增或从基因文库中提取，随后克隆到适合的质粒载体上，如pUC系列质粒，便于后续操作。
②载体选择与准备：根据表达系统（细菌、酵母、哺乳动物细胞等）和目的蛋白特性，选择合适的表达载体，如pET系列（原核）、pYES2（酵母）、pcDNA3.1（哺乳动物）。
载体需预先线性化或具有特定限制酶切位点。
③酶切与连接：使用限制性内切酶对目的基因片段和载体分别进行酶切，以产生相匹配的黏性末端或平末端。
之后，通过T4 DNA连接酶将目的基因片段连接到载体上。
④转化与筛选：将连接产物转入相应的宿主细胞（如大肠杆菌DH5α），通过热激、电击等方法促进细胞吸收DNA。
随后在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出含重组载体的阳性克隆。
⑤验证与测序：挑取阳性克隆，通过PCR、酶切分析或直接测序等方法验证目的基因是否正确插入载体，以及阅读框是否正确。
⑥表达验证：将验证后的重组载体转入最终的表达宿主细胞中，诱导表达目标蛋白，通过SDS-PAGE、Western Blot等方法检测蛋白的表达效率及特性。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
克隆载体构建 Protocol
克隆载体构建是一个生物学实验中常用的过程，用于将目的基因插入到特定的DNA序列中，以便在细胞内进行表达和功能研究。
以下是克隆载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、所需试剂和耗材1.限制性内切酶：用于识别和切割特定的DNA序列。
2.DNA连接酶：用于将目的基因与载体DNA连接在一起。
3.质粒DNA：用作克隆载体的DNA分子，通常使用经过改造的质粒。
4.目的基因：需要插入克隆载体的DNA片段。
5.T4 DNA连接酶：用于将目的基因与载体DNA连接在一起。
6.缓冲液：用于维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。
7.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
8.无菌水：用于稀释和配制溶液。
9.酚/氯仿/异戊醇混合液：用于抽提质粒DNA。
10.氯仿：用于沉淀和分离DNA。
11.无水乙醇：用于洗涤和沉淀DNA。
12.70%乙醇：用于清洗PCR管和其他器具。
二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。
2.离心机：用于离心DNA溶液和其他反应液。
3.水浴锅：用于保温反应液。
4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。
5.PCR仪：用于扩增目的基因。
6.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。
7.紫外分光光度计：用于测量DNA浓度。
8.显微镜：观察细胞和组织样品。
三、准备工作1.阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。
5.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
6.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
7.设置PCR仪的温度循环程序以及其他相关参数。
8.计算所需的质粒DNA和目的基因的摩尔数，以便进行后续反应。
四、实验方法1.用酚/氯仿/异戊醇混合液抽提质粒DNA，并将其沉淀在氯仿中。
构建克隆载体步骤
构建克隆载体步骤构建克隆载体主要有以下步骤：一、基本动作要领1. 目的基因的获取- 首先，如果是从基因组DNA中获取目的基因，咱们就得先提取基因组DNA。
就像摘果子得先找到果树一样，这里提取基因组DNA的方法有很多，像酚- 氯仿抽提法就比较经典。
提取的时候，一定要保证样本的新鲜度。
我之前就做错过，用了放置很久的样本，结果提取出来的DNA 质量特别差。
如果是从mRNA经反转录得到cDNA再获取目的基因的话，就要注意mRNA的质量了。
要使用质量好的逆转录酶，这就好比建房子得用好的砖头，mRNA就是建基因这座“房子”的砖头。
2. 载体的选择- 载体就像是一辆“车”，用来搭载我们的目的基因。
常见的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
如果是简单的在细菌里克隆，一般就选质粒载体。
要根据自己的实验需求来选，比如要有合适的筛选标记，像抗药性基因之类的，这样才能方便后续筛选出带有重组载体的细胞。
3. 目的基因和载体的酶切- 这是很关键的一步，要选择合适的限制性内切酶。
就像开锁得用对钥匙一样，酶切位点必须是载体和目的基因上都有的，而且要在合适的反应体系里进行。
酶切反应的缓冲液、温度、反应时间都得严格控制。
我试过好多次，温度稍微不对，酶切就不完全。
反应体系里的底物浓度也要合适，别加太多或者太少的DNA，就像做菜加盐一样，得适量。
- 给大家简单画个示意图来理解一下。
就好比长条形的目的基因和环状的载体，用内切酶在特定的位置“咔嚓”一刀，这样就产生了可以连接的黏性末端或者平末端。
二、个人小技巧1. 在酶切之前，可以先做个小的预实验。
就像试水温一样，看看用什么浓度的酶、多长的反应时间是最合适的。
对了这里可以把目的基因和载体分别做预酶切，这样如果有问题就可以很快定位是哪一个的问题。
2. 在选择内切酶的时候，尽量选择产生不同黏性末端的酶，这样在连接的时候特异性会更好。
这就好比把两个不同形状的拼图碎片拼在一起，不容易拼错。
三、容易忽视的细节1. 酶切完后一定要进行凝胶电泳来检验酶切产物是否正确。
克隆载体与表达载体
分类
结构组成及表达兀件
特点或优点
备注
质 粒 表 达 载 体
原核表达载 体
1启动子、
2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干
扰载体的稳定性）
（1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cl失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型人 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型， 称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏 感）
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力
5
色
体
细菌人工染色体 载体
BAC
是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通量低拷 贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子） 的严谨型控制的复制子oriS（Shizuya et al.
主要使用EcoR I
ColEl
天然质粒，属松弛型多拷贝型
6.3 kb
大肠杆菌素（colicin） E1和对E1免疫的 基因（immE1）
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1 （ColE1-），但仍然 表现出对E1免疫型（皿1^1+）
pBR322
兀件来源①复制起点orip
酵母人工染 色体载体YAC细菌人工染 色体载体BAC
P1噬菌体人 工染色体载 体PAC
质粒载体总结
质 粒 载 体
类型
长度
选择标记
克隆位点
pSC101
分子克隆之载体构建完整步骤
分子克隆之载体构建完整步骤一、目的片段的扩增和酶切PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。
准备：A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落B.引物配制：a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。
b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul工作液。
终浓度200-400nM。
1. PCR反应体系(50ul)Taq酶体系：Thermo10x buffer （无Mg2+）5ulMgCl2（25mM）5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulTaq DNA聚合酶0.5ulddH2O 补充至50 ul注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。
2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。
PCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30-35：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4-10℃ 保温高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo10x buffer 5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板DNA或cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulpfu DNA聚合酶1ulddH2O 补充至50 ulPCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-5℃，特殊酶如NEB公司Phusion高保真酶需要高退火温度，参考官网）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：pfu酶合成效率约600-1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4℃ 保温2. 琼脂糖凝胶电泳验证取5ul样品+1ul DNA Loading buffer（6x）混匀上样，150V恒压电泳30min，凝胶成像仪紫外观察保存电泳图片。
克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
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一、稀释引物
1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）
2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）
4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、
上引物0.8ul
下引物0.8ul
Mix 10ul
DNA（日本晴）1ul
DD水7.4ul
三跑高保真酶（50ul体系）
DNAorCDNA 2ul
上引物2ul
下引物2ul
5*buffer 10ul
dNTPs 5ul
DD水28ul
Pfu（最后加）1ul
四胶回收流程
1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）
6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系
上引物0.4ul
下引物0.4ul
Mix 5ul
回收产物1ul
DD水 3.2ul
六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）
胶回收产物 3.5ul
Blunt cloning 0.5ul
混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃
之后转化
1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
4、加入900ulSOC培养基，混匀。
5、37℃，160r摇床1h，使细菌复苏。
6、取出后离心3000r，2min。
7、吸出上清，留下100-150ul左右冻在LB 100ml+kana或者A 固体培养基上。
8、涂板，37℃过夜培养。
9、挑单菌落（一般不超过7个）加入到10ul的DD水中。
菌液PCR体系（10ul体系）
上游引物0.4ul
下游引物0.4ul
Mix 5ul
菌液1ul
DD水 3.2ul
之后跑电泳，若有目的条带则继续。
七摇菌
菌液+LB液体（加抗生素）-------L管（过夜摇菌）
第二天500ul菌液+500ul甘油混匀保存2管，其中一管送检，另一管-70℃保存。
若检测结果正确
八、提取质粒
1、在1.5ul的EP管中收集菌液，10000转，1min，弃上清，重复一次。
2、加205ul solution I（提前预热），用枪头打匀，室温静置2min。
3、加250ul solution II（提前预热），混匀，室温静置2min。
4、加350ul solutionIII，混匀，室温静置2min（有白色丝状物产生）
5、13000转，10min，取700ul上清液于吸附柱中，10000转，1min。
6、加500ul HBbuffer，12000转，1min，倒掉废液。
7、加700ul DNA wash buffer，13000转，1min，倒掉废液，重复一次。
再空离心2min 13000转。
8、37℃烘箱中干燥5分钟，加50ulDD水溶解，静置2min，离心13000转，2min。
九做酶切（50ul）
DD水19ul
K-B 5ul
质粒20ul
bamI 3ul
HIndIII 3ul
之后37℃烘箱，不超过16h
十、加5ul lodding buffer
若有条带胶回收。
十一胶回收（步骤同四）
十二做连接，连接表达载体
目的基因（胶回收的）4ul
载体（1300）1ul
DD水2ul
Buffer 2ul
T4连接酶1ul
过夜16℃，水浴连接。
十三、连接后转化，同“六”
十四、挑条单菌落
跑菌落PCR，若有条带，将剩下的9ul +LB液体+K 加入L管过夜培养。
十五、取L管500ul与500ul 甘油加入EP管中，并与-70℃保存
将L管剩下的菌液取1ul跑菌落PCR（10ul体系）
跑电泳检测结果。
十六提质粒
十七酶切检测
DD水7ul
K-B 1ul
质粒1ul
BamI 0.5ul
HinIII 0.5ul
37℃2.5h后可以检测。