细胞内细胞因子染色
T细胞的分化培养、染色
T细胞的分化培养脾细胞的分离与计数：过滤PBS 10mL于离心管中，杀小鼠，取脾脏放入此PBS，冰浴。
配含10% FBS的1640培养液（5ml+45ml）。
平皿中研碎脾脏。
加PBS离心（1400 rpm,7 min)。
去上清，加2-3mL红细胞裂解液，吹打，静置5min。
加10 ml 1640（稀释掉裂解液），过滤（过筛），离心（1400 rpm，7 min）。
去上清，加之前配好的培养液3 mL打匀得悬液。
取少许入小管，于小管中取20uL，加20uL台盼蓝（染上死细胞）。
细胞计数，16大格板，计左上和右下对角线的各16小格。
算得结果。
此时细胞密度=一个角的16格细胞数×104/mL，由于台盼蓝稀释，再×2。
参照加样体积，取适量悬液用培养液稀释成1.5-2.5×106个/mL。
=台盼兰染色后150-250cells/左上16格+右下16格细胞因子的分装：原管分别含IL-2 :20 μg,IL-4 :10μg ,IL-12 :10μg ,TGF-β:1μg。
分别取1 ml所配培养液加入rmIL-2,rmIL-4,rmIL-12,rmTGF-β。
配1μg/ml的IL-2，100μL/管。
配1μg/ml的IL-4。
100μl/管。
配1μg/ml的IL-12。
50μl/管。
配1μg/ml 的TGF-β。
50μl/管。
分装1μg/ml的GM-CSF。
20uL/管。
细胞的激活培养：在总加样体积的细胞悬液中，加入下列细胞因子与抗体：稀释800倍的Anti-CD3（5ug/mL），稀释1000倍的Anti-CD28（1ug/mL），稀释500倍的IL-2（2 ng/mL）。
于48孔板上选取8孔，每2孔分别对应Th1,Th2,Treg及对照。
每孔500uL培养液，8孔共4 mL。
Th1：加入200倍稀释的IL-12，100倍稀释的Anti-IL-4（10ug/ml）。
Th2：加入50倍稀释的IL-4（20 ng/ml），100倍稀释的Anti-IFN-γ（10 ug/ml）。
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
t细胞效应检测方法
t细胞效应检测方法标题：深入了解T细胞效应检测方法T细胞是人体免疫系统的重要组成部分，负责识别并消灭感染和异常细胞。
在研究和临床实践中，准确检测T细胞的效应功能对于评估免疫状态和疾病进展至关重要。
本文将详细介绍几种常见的T细胞效应检测方法。
一、T细胞增殖实验T细胞增殖实验是检测T细胞功能的一种基础方法。
该实验通常通过以下步骤进行：1.收集待检测的T细胞样本。
2.将T细胞与特异性抗原或刺激剂共同培养。
3.通过细胞计数、放射性标记物摄取或其他检测手段评估T细胞的增殖情况。
二、细胞因子释放实验细胞因子是T细胞活化后分泌的免疫调节蛋白。
通过检测细胞因子的释放，可以评估T细胞的效应功能。
常见的细胞因子释放实验有以下两种：1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过特异性抗体捕获细胞因子，然后进行定量分析。
2.流式细胞术：利用荧光标记的抗体检测细胞因子分泌情况。
三、T细胞杀伤实验T细胞杀伤实验是评估T细胞对靶细胞杀伤能力的方法。
常见的方法有：1.51Cr释放实验：将放射性同位素标记的靶细胞与T细胞共培养，通过测定释放的放射性同位素量来评估T细胞的杀伤能力。
2.非放射性细胞毒性实验：利用荧光染料、钙离子指示剂等代替放射性同位素，评估T细胞对靶细胞的杀伤作用。
四、流式细胞术流式细胞术是一种高精度的细胞检测技术，可以评估T细胞的多种功能，如：1.表型分析：通过检测细胞表面的标记物，了解T细胞的亚群分布和活化状态。
2.细胞内细胞因子染色：检测T细胞内特定细胞因子的表达情况。
五、免疫组化技术免疫组化技术是检测组织中T细胞分布和功能的一种方法。
通过特异性抗体与T细胞表面或细胞内分子结合，然后利用染色剂显色，观察T细胞在组织中的分布和活化状态。
总结：T细胞效应检测方法多种多样，研究人员可以根据实验需求和条件选择合适的方法。
10种常用细胞因子检测方法盘点
10种常用细胞因子检测方法盘点细胞因子是一类在细胞间相互作用中发挥重要作用的蛋白质，对免疫调节、炎症反应、细胞增殖和分化等过程起着关键的调控作用。
因此，检测细胞因子的水平对于研究疾病发病机制、诊断和治疗具有重要意义。
以下是常用的10种细胞因子检测方法盘点：1. 酶联免疫吸附法（ELISA），ELISA是一种常用的细胞因子检测方法，通过将待检测的细胞因子与特异性抗体结合，然后用酶标记的二抗结合，最后通过底物染色来检测细胞因子的含量。
2. 免疫荧光法（IF），IF方法利用激光共聚焦显微镜观察标记的抗体与细胞因子结合的情况，适用于定量和定位分析。
3. 流式细胞术（FCM），FCM结合荧光标记的抗体，可以对多种细胞因子进行快速、高通量的检测和分析。
4. 生物传感器技术，生物传感器技术结合了生物学和传感器学的优势，可以实现对细胞因子的高灵敏度、高选择性检测。
5. 蛋白质芯片技术，蛋白质芯片技术可以同时检测多种细胞因子的含量，具有高通量、高灵敏度的特点。
6. 质谱法，质谱法可以通过检测细胞因子的质荷比来定量和鉴定细胞因子。
7. 生物学功能法，生物学功能法通过观察细胞因子对细胞生物学功能的影响来间接检测细胞因子的活性。
8. 核酸杂交技术，核酸杂交技术可以通过检测细胞因子的mRNA水平来间接反映细胞因子的表达水平。
9. 免疫印迹法（Western blot），Western blot可以用于检测细胞因子的蛋白质水平，结合特异性抗体可以实现对细胞因子的定量分析。
10. 细胞因子生物学活性检测，通过细胞因子对细胞增殖、分化、凋亡等生物学活性的影响来检测细胞因子的活性水平。
以上是常用的10种细胞因子检测方法，它们各自具有特定的优势和局限性，在实际应用中可以根据需要选择合适的方法进行检测分析。
FACS 胞内染色
流式胞内染色实验方法方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。
注意：1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。
2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。
3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。
不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。
4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。
5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
方案A: 两步法胞内（细胞质）蛋白染色实验材料：12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。
实验流程：1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。
缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。
斡旋分散细胞。
3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定细胞。
室温避光孵育20min。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
流式胞内染色步骤
一、surface marker染色
1、收获细胞，用1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
2、加入预先配置好的surface marker抗体混合液（溶于50ul 1%BSA
/PBS），用枪轻轻吹打充分混匀，4度孵育30分钟。
3、1%BSA /PBS 1ml洗涤一次（1500rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
二、Intracellular Staining的步骤
1、Fix/permeabilizatioin Buffer（ebioscience）固定破膜剂
2、固定：加入IC Fix/Perm Buffer 100ul 后，混匀，室温孵育20分钟
3、用1x Perm Wash Buffer 1ml洗涤1次（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
4、破膜：加入1x Perm Wash Buffer 1ml，混匀，4度孵育45分钟。
5、离心（2000rpm，10min），倾倒后滤纸吸干管口液体。
6、加入细胞因子抗体（溶于50ul 1x Perm Wash Buffer），4度孵育45分钟。
7、最后再用1xPerm Wash Buffer 1ml洗一次，倾倒后，加入适量300ul PBS 重悬细胞。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法细胞因子是一类负责细胞之间相互通讯的蛋白质分子，在生物体中起着重要的调节和调控作用。
细胞因子检测是研究细胞因子功能及其相关疾病机制的重要手段。
本文将介绍常见的细胞因子检测方法，包括免疫学方法、PCR方法以及生物芯片技术。
免疫学方法是常用的细胞因子检测方法之一。
这种方法基于细胞因子与抗原抗体的特异性结合来进行检测。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫荧光法和免疫组化染色法等。
ELISA是最常用的细胞因子检测方法之一。
该方法利用酶标记的抗体与待测的细胞因子特异性结合，通过酶的催化作用使底物发生显色反应，从而进行定量测定。
ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和较大的线性测定范围，广泛应用于临床实验室检测细胞因子水平。
免疫荧光法是通过荧光标记的抗体与待测的细胞因子结合，并通过荧光显微镜观察标记信号来进行检测。
该方法具有高灵敏度和高特异性，可以用于检测细胞因子的定位和分布，广泛应用于生物医学研究中。
免疫组化染色法是一种利用酶标记或荧光标记的抗体与待测的细胞因子结合，并利用酶的催化作用进行染色反应的方法。
通过染色的程度可以判断细胞因子的表达水平及分布情况。
这种方法常用于组织学研究和病理学鉴定中。
PCR方法是一种通过扩增特定DNA序列来进行细胞因子检测的方法。
该方法适用于细胞因子的基因表达研究。
常见的PCR技术包括逆转录PCR、实时荧光定量PCR和单细胞PCR等。
逆转录PCR是一种将RNA转录为cDNA并进行扩增的方法。
该方法通过反转录酶将RNA转录为cDNA，再利用DNA聚合酶扩增所得的cDNA，最终通过凝胶电泳或其它方法来检测细胞因子的基因表达水平。
实时荧光定量PCR是一种可以实时监测DNA扩增过程的PCR方法。
该方法基于荧光信号的累积产生来实时监测扩增产品的数量，从而测量初始模板的绝对量或相对量。
单细胞PCR是一种可以在单个细胞水平检测细胞因子基因表达的PCR方法。
该方法通过将单个细胞在微小反应体系中进行逆转录、扩增和检测，从而实现对细胞因子在单个细胞中的表达水平研究。
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细胞内细胞因子染色
胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂
I. 抗体
1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)
2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)
注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替
II. 其他材料：
1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)
2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)
3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.
4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)
5. Ionomycin (Sigma I9657)
仪器
1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)
步骤
1. 刺激细胞：
1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞
2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。
（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）
2. 收集细胞:
1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞
2) 收集细胞用PBS.重悬两次
3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL
4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)
5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋
6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋
3. 细胞表面抗原染色
1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。
2) 用100μl表面抗体混合液重悬（推荐稀释倍数：1:100 PBS/2% FBS）。
室温避光孵育20分钟，离心。
3) 预冷PBS洗一遍
4. 细胞内抗原染色
1) 200μlBD Cytofix/CytoPerm溶液重悬。
室温避光孵育30min，500 x g, 3 minutes, 4℃离心
2) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心
3) 用100μl 细胞因子染液重悬 (推荐稀释倍数: 1:100 in 1X Perm/Wash). 冰上避光孵育,30 mini按12步离心.
4) 用200μl BD Perm/Wash buffer清洗两次. 按12步离心
5) 用 300-400μl FACS buffer 重悬细胞并转移到 Falcon 圆底试管中用用流式细胞仪操作。
参考文参:
1. Eur. J. Immunol. 1994 24:1097-1101.
2. Clin Cancer Res 2004 10(20):6946-5。