第二章 生物样品的制备
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第二章 样品的采取、制备、
生物鉴定法
biological identification 精密度precision 准确度accuracy 灵敏度sensitivity 偶然误差accidental error 偏差deviation
变异系数
coefficient of variation 标准偏差standard deviation
将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上注明名称采样日期交货数量采样方法及注明名称采样日期交货数量采样方法及其他应说明的情况并由经手人签封其他应说明的情况并由经手人签封样品的采取样品的采取制备处理和保存样品的采取制备处理和保存前页前页前页前页后页后页后页后页首页首页首页首页
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样品的采取、制备、处理和保存
采样实例
全脂奶粉取样
V 桶箱包装：开启总数的1％，用83㎝长的开口钎，先加 以杀菌，然后自容器的四角及中心各采一钎，放在盘 中，采取约总量的1‰为检验用。
V 瓶装、听装：按批号分开，自该批产品堆放的不同部 位采取总数的1‰，但不得少于2件。尾数超过500件应 加抽1件。
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加标样品additional sample
样品的采取、制备、处理和保存
第一节 样品(sample)的采取
正确采样(sampling)的意义和概念 V 采样：从产品中抽取有一定代表性样品，供分析检验的 过程。
V 检样：由整批食物的各个部分采取的少量样品称为检样 V 原始样品(original sample)：把许多份检样综合在一起称
V 有机物破坏法：食品中无机盐或金属离子的测定。 )干法灰化(dry ashing):通过灼烧手段分解食品的方法。 ) 湿法灰化(wet ashing):通过加入强氧化剂(如浓硝酸、 高氯酸、高锰酸钾等)消化食品的方法。
biological identification 精密度precision 准确度accuracy 灵敏度sensitivity 偶然误差accidental error 偏差deviation
变异系数
coefficient of variation 标准偏差standard deviation
将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中瓶签上注明名称采样日期交货数量采样方法及注明名称采样日期交货数量采样方法及其他应说明的情况并由经手人签封其他应说明的情况并由经手人签封样品的采取样品的采取制备处理和保存样品的采取制备处理和保存前页前页前页前页后页后页后页后页首页首页首页首页
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样品的采取、制备、处理和保存
采样实例
全脂奶粉取样
V 桶箱包装：开启总数的1％，用83㎝长的开口钎，先加 以杀菌，然后自容器的四角及中心各采一钎，放在盘 中，采取约总量的1‰为检验用。
V 瓶装、听装：按批号分开，自该批产品堆放的不同部 位采取总数的1‰，但不得少于2件。尾数超过500件应 加抽1件。
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加标样品additional sample
样品的采取、制备、处理和保存
第一节 样品(sample)的采取
正确采样(sampling)的意义和概念 V 采样：从产品中抽取有一定代表性样品，供分析检验的 过程。
V 检样：由整批食物的各个部分采取的少量样品称为检样 V 原始样品(original sample)：把许多份检样综合在一起称
V 有机物破坏法：食品中无机盐或金属离子的测定。 )干法灰化(dry ashing):通过灼烧手段分解食品的方法。 ) 湿法灰化(wet ashing):通过加入强氧化剂(如浓硝酸、 高氯酸、高锰酸钾等)消化食品的方法。
生物样品制备
1.2 注意事项 • 采样要有代表性(体液：几μL ，器官组织：几 mg); • 采样时机； • 采样部位准确； • 采样后应立即加以处理，如采好血样后立即加 抗血凝剂，组织器官加防腐剂，动物样品速冻处 理，植物样品脱水处理。 • 采用工具需消毒，最好经过无毒处理。
2 细胞破碎 2.1 目的
破坏细胞外壳，使细胞内含物有效地释放出来。 即：将生物体细胞内及多细胞生物组织中的待测组 分(如激素、酶、基因工程产物等)充分释放到溶液 中。 不同的生物体
(2) 盐析法 原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶 解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。 在低盐浓度下，蛋白质溶解度随着盐浓度升 高 而增加－－盐溶作用； 当盐浓度不断升高时，不同蛋白质溶解度又以
不同程度下降，并先后析出沉淀－－盐析作用。 （这是蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团的静电引力造成的。由于水中
表面活性剂处理法：
常用的有：十二烷基磺酸钠
氯化十二烷基吡啶
去氧胆酸钠
其他方法：
改变细胞膜透性、破坏蛋白质与脂类结合等。 如真空干燥、制成丙酮粉。 注意：
• 无论用哪一种方法破碎细胞，都需要在一定的
稀盐溶液或缓冲溶液中进行；
• 一般还需加入保护剂防止生物大分子变性和
降解。
二 生物大分子的提取与蛋白质的去除
加入少量盐，增加了溶液的极性，减弱了蛋白质分子间的作用力，促使其溶解 度增大。当盐浓度增加到一定程度时，水活度被降低，蛋白质表面的电荷大量 被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子又相互聚集而沉淀析出。）
盐析法的优点： 对设备和条件要求低，安全，应用范围广泛； 一般可在室温下操作； 常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、 氯化钠、磷酸钠等。 硫酸铵的盐析能力强，饱和液浓度大，溶解
gsg-第二章 生物样品的制备
32
细胞破碎相关的器械与器材
• 1)电动组织捣碎机
• 原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在 高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。 • 市售仪器多数是可调速机型，有不同口径 、头端式样的转子供选择，平头转子适于 制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制 备组织和含纤维物质的匀浆。 • 应用：一般用于动物组织，植物肉质种子， 柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高 转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械 切力很大，制备较大分子样品很少使用。 动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和 细菌需加入石英砂加强效果。
2. 通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、 化学以及生物学性质
3. 生物材料的破碎和预处理 4. 分离纯化方法的选择和探索 5. 选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备 物的均一性（即纯度）的方法 6. 产物的浓缩、干燥和保存 基本原则： 以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得 尽可能多的目标产品
可将自然流出的唾液1～2mL ，置干净容器内置冰冻保存 ，或者立即
放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4℃冰箱 保存。
18
生物材料的选择
（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低）
2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）
3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的 药物或毒物）
33
超声波细胞破碎机
• 原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器
。由超声波发生器和超声换能器两部分极成。
• 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满 足0.1~250ml的容量需要。 • 应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用 于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消
细胞破碎相关的器械与器材
• 1)电动组织捣碎机
• 原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在 高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。 • 市售仪器多数是可调速机型，有不同口径 、头端式样的转子供选择，平头转子适于 制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制 备组织和含纤维物质的匀浆。 • 应用：一般用于动物组织，植物肉质种子， 柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高 转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械 切力很大，制备较大分子样品很少使用。 动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和 细菌需加入石英砂加强效果。
2. 通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、 化学以及生物学性质
3. 生物材料的破碎和预处理 4. 分离纯化方法的选择和探索 5. 选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备 物的均一性（即纯度）的方法 6. 产物的浓缩、干燥和保存 基本原则： 以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得 尽可能多的目标产品
可将自然流出的唾液1～2mL ，置干净容器内置冰冻保存 ，或者立即
放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4℃冰箱 保存。
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生物材料的选择
（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低）
2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）
3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的 药物或毒物）
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超声波细胞破碎机
• 原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器
。由超声波发生器和超声换能器两部分极成。
• 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满 足0.1~250ml的容量需要。 • 应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用 于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消
第二章 试样的采取、制备和分解
§2—1 试样的采集
1、采样数量
数量要求：
1）至少满足三次重复检测的需要；2）有需要时必 须满足备考样品的需要；3）满足样品制备的需要。 数量过多——造成浪费 数量过少——不能满足代表性要求
在满足需要的前提下，样品数量越少越好。一般根 据经验公式计算最低采样量。
§2—1 试样的采集
四、采样记录和样品保存
采样时应记录被采物料的状况和采样操作， 如物料的名称、来源、编号、数量、包装情 况、存放环境、采样部位、所采样品数量、 采样日期、采样人等。 样品采集好后应包装，贴上标签，送至制样 室，如不能及时分析，一般只能存放6个月， 特殊样品另当别论。
冷冻干燥法 样品放在冷冻干燥室内，抽真空至 1.3-6.5bar（10-50mmHg),水变成冰，2-3天后冰 全部升华。 用于水样的浓缩，植物、动物血清和其它含有易 挥发组分的干燥
NBS的果叶、牛肝、菠菜叶、松针、米粉、面粉、 河沉积物等标准物质用冷冻干燥技术，未发现易 挥发的As,Hg等损失，I有明显损失，Br在酸性溶 液中有损失。
0.2
9.03 2.26 0.80
0.3
13.55 3.39 1.20
0.5
22.6 5.65 2.00
1.0
45.2 11.3 4.00
20
40 60 80
0.83
0.42 0.25 0.177
0.069
0.018 0.006 0.003
0.14
0.035 0.013 0.006
0.21
0.053 0.019 0.0将表面刮去0.1m，深入0.3m 挖取一 个子样的物料量，每个子样的最小质量不小于5kg。最后合并 所采集的子样。
生物样品前处理、制备、分离
生物样品前处理、制备、分离及保存器材
添加副标题
中国刑警学院法医系
1. 概 述 1.1 生物样品处理制备的主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵许多生物样品在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物样品一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物样品提取制备最困难之处。 ⑷生物样品的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
样品置耐压的圆底烧瓶中，将瓶浸入干冰-乙醇混合物内，使瓶内物迅速冻结成硬块，然后连接高真空度的真空泵。
*
增加过滤推动力。常压、加压、减压。
加助滤剂。如硅藻土、活性炭、细砂等。
提高过滤时的温度。以减少溶液粘度，增大溶质的溶解度，但不适于热敏物质。 离心过滤法，利用离心力促使滤液通过过滤介质，适于分离小量组织样品。
加压和减压过滤在过滤介质的下面都必须有支持滤板，如强度较大的烧瓷滤板等。
3.2 超滤 超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。
滤渣：滤渣越厚，过滤速度越慢。
过滤液性状：过滤液中有沉淀、胶状物或其它可压缩的物质，均能造成滤膜孔堵塞，减慢过滤速度。
*
3.1.3 提高过滤速度的常用方法
选择适当的过滤介质 应考虑：①孔径大小应适于截流被分离的固体颗粒，孔径过大，则滤液不清，过小则滤速慢。②孔的数目多，孔道短且直，则滤速快，否则滤速慢。③耐酸碱，化学稳定性好。④有一定机械强度，易于回收。⑤使用寿命长，成本低。 过滤介质的材质： ①棉、麻、丝织品； 玻璃纤维、垂熔玻璃、石棉或烧瓷滤板、涤纶等； 滤纸（工业用和分析用，慢速、中速、快速），实验室里最常用。
体内药物分析
体内药物分析第二章生物样品与样品制备1.体内药分的对象：人体和动物体液、组织、器官、排泄物 2．体内药物分析的特点：样品量少，不易重新获得；样品复杂，干扰杂质多；供临床用药监护的检测分析方法要求简便、快速、准确，以便迅速为临床提供设计合理的用药方案及中毒解救措施；实验室拥有多种仪器设备，可进行多项分析工作；工作量大，测定数据的处理和阐明有时不太容易。
需相关学科参与。
3．体内药物分析样品的种类：最常用且易获得的分析样品有：血样、尿样、唾液和粪便。
特殊情况下：乳汁、泪液、脊髓液、胆汁、羊水、各种组织4．血清：血清是由血液中纤维蛋白原等的影响引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，约为全血的30%?50%5．尿液：尿液的主要成分：水、含氮化合物、盐类；体内药物清除主要通过尿液排出，药物以其原型或代谢物及其缀合物等形式排出；尿药测定主要用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、药物代谢率的研究，并可推断患者是否按医嘱用药。
6．生物样品分析的前处理：是指测定生物样品中的药物及其代谢物时，对样品进行分离、纯化、浓集，必要时对待测组分进行衍生化，为测定创造良好的条件。
7．为何进行前处理？1）药物进入体内除原药外还有多种形式存在2）生物样品的介质组成比较复杂，尤其蛋白质严重影响分离效果，必须进行前处理3）除去介质中含有的大量内源性物质等杂质，提取出低浓度的被测药物，同时浓集药物或代谢物的浓度，使其在所用分析技术的检测范围内。
8．生物样品处理方法选择的一般原则：待测药物的理化性质；待测药物测定的目的与浓度范围。
9．去除蛋白质的方法：加与水相混溶的有机溶剂；加入中性盐；加入强酸；加入含锌盐及铜盐的沉淀剂；酶解法。
10．生物样品的分析由两步组成：样品的前处理（分离、纯化与浓集）和对提取物的仪器分析；提取法是应用最多的分离、纯化方法；提取的目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集，以供测定；提取法分为液 -液提取法和液 - 固提取法。
生物样品的制备与提取
第二章生物样品的制备§2. 1 生物分析化学分析对象的复杂性生物样品往往是一种具有高度复杂性的体系，这种复杂性表现在组成、含量、动力学范围、时空依存性等各个方面，这使得生物样品的处理有很大的难度。
因此，与经典分析化学的样品制备相比，生物分析化学的样品制备有以下特点：（1）生物样品的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
如人类血浆蛋白质组学的阶段性研究结果表明，正常人血浆中的蛋白质至2005年时已鉴定了3020种。
有的生物分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是很困难的。
（2）许多生物分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。
分离纯化的步骤繁多，流程长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。
（3）生物分子往往有很宽的动力学浓度范围。
如不同的蛋白质在细胞内的浓度分布范围相差106～1010倍，而同一种蛋白质在不同的生理或病理状态下浓度相差有时也很大。
（4）许多生物分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物分子提取制备最困难之处。
过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活。
（5）生物分子的分离和制备几乎都是在溶液中进行的，很难准确估计和判断温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种成分的综合影响，因而实验结果常常带有很大的经验成份，实验的重复性较差，分析仪器、分析方法学、乃至个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
制备生物分子的基本原则是：以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得尽可能多的目标产品。
通常包括以下步骤：①确定要制备的生物分子的目的和要求；②通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、化学以及生物学性质；③生物材料的破碎和预处理；④分离纯化方案的选择和探索；⑤选择相应的、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备物的均一性（即纯度）的方法；⑥产物的浓缩、干燥和保存。
采样、样品制备和预处理
平均，均匀地分出的一部分
复检样品：在对检验结果有争议或分歧时作
复检用 保留样品：需封存保留一段时间（通常一个
月），以备有争议时再作验证，但易变质 食品不作保留。
4.采样的一般方法
随机抽样
代表性取样
按照随机原则，从大批 初料中抽取部分样品。
所有初料的各个部分都 有被抽到的机会
用系统抽样法进行采样，根据 样品随空间（位置）、时间变 化的规律，采集能代表其相应 部分的组成和质量的样品。 （如分层取样、随生产过程流 动定时取样、按组批取样、定 期抽取货架商品等 ）
10）感官不合格产品不必进行理化检验，直接判为 不合格产品。
二、样品制备
（一）样品制备
按采样规程采取的样品往往数量过多，颗粒太大， 组成不均匀。
必须对样品进行粉碎、混匀、缩分——样品制备
1.样品制备的总原则
要防止易挥发性成分的逸散 、避免样品组成和 理化性质发生变化 ；
做微生物检验的样品，要按照无菌操作规程制 备
（8）超声波辅助萃取（Ultrasonic Assisted Extraction，UAE）
超声波发生器能发出高频振荡讯号，通过换 能器可以转换成高频机械振荡而传播到介质 中，超声波在介质中疏密相间地向前辐射， 使介质流动而产生数以万计的微小气泡，由 空化效应而形成超过1000个大气压的瞬间 高压，从而加速了溶剂萃取过程。
亚临界水与常温常压下的水在性质上有 较大差别，它类似于有机溶剂
水在250℃时介电常数为27，介于常温 常压下乙醇(ε=24)和甲醇(ε=33)之间
对中等极性和非极性有机物具有一定的 溶解能力
适用：处理各种固体和半固体样品中的 挥发性和半挥发性有机物
静态SBWE主要是通过控制加热的温度， 压力和时间等因素来到达最优萃取条件。
复检样品：在对检验结果有争议或分歧时作
复检用 保留样品：需封存保留一段时间（通常一个
月），以备有争议时再作验证，但易变质 食品不作保留。
4.采样的一般方法
随机抽样
代表性取样
按照随机原则，从大批 初料中抽取部分样品。
所有初料的各个部分都 有被抽到的机会
用系统抽样法进行采样，根据 样品随空间（位置）、时间变 化的规律，采集能代表其相应 部分的组成和质量的样品。 （如分层取样、随生产过程流 动定时取样、按组批取样、定 期抽取货架商品等 ）
10）感官不合格产品不必进行理化检验，直接判为 不合格产品。
二、样品制备
（一）样品制备
按采样规程采取的样品往往数量过多，颗粒太大， 组成不均匀。
必须对样品进行粉碎、混匀、缩分——样品制备
1.样品制备的总原则
要防止易挥发性成分的逸散 、避免样品组成和 理化性质发生变化 ；
做微生物检验的样品，要按照无菌操作规程制 备
（8）超声波辅助萃取（Ultrasonic Assisted Extraction，UAE）
超声波发生器能发出高频振荡讯号，通过换 能器可以转换成高频机械振荡而传播到介质 中，超声波在介质中疏密相间地向前辐射， 使介质流动而产生数以万计的微小气泡，由 空化效应而形成超过1000个大气压的瞬间 高压，从而加速了溶剂萃取过程。
亚临界水与常温常压下的水在性质上有 较大差别，它类似于有机溶剂
水在250℃时介电常数为27，介于常温 常压下乙醇(ε=24)和甲醇(ε=33)之间
对中等极性和非极性有机物具有一定的 溶解能力
适用：处理各种固体和半固体样品中的 挥发性和半挥发性有机物
静态SBWE主要是通过控制加热的温度， 压力和时间等因素来到达最优萃取条件。
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斯维得贝格单位（Svedberg unit）:10-13S 沉降速度：
在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。
K系数： 用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。
3
离心技术的分类
粗制品提取
1）差速离心法---不同粒子在离心力场沉降的差别 2）速率区带离心法---粒子在梯度液中沉降系数不同 3）等密度离心法---粒子颗粒密度不同
的目的。
2.7.1 固相萃取的模式及原理
固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其
主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、
反相、离子交换等几种类型。固相萃取所用的 吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是 在粒度上有所区别。 吸附剂： 正向固相萃取 ---极性 反相固相萃取---非极性或极性较弱
2.7.2 固相萃取常用的吸附剂
剧烈程度
应用对象
2.5 生物大分子的提取
2.5.1 水溶液提取 盐浓度（离子强度） pH 影响 因素 温度 防止降解作用 搅拌与氧化
2.5.2 有机溶剂提取 对于一些难溶的蛋白质和酶，常用不同比例的有机 溶剂提取。 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。 有些蛋白质和酶既能溶于稀酸、稀碱，又能溶于含
中性盐沉淀 （盐析法）
盐析的操作方法—固体硫酸铵加入法
蛋白质的浓度
盐析的影响因素
pH 温度
基本原理：降低水溶液的介电系数 2
有机溶剂 沉淀法
有机溶剂的选择和浓度的计算—乙醇、甲醇、丙酮 V=V0(S2-S1)/(100-S2)
温度 样品浓度 pH 离子强度
影响因素
热变性 3
选择性变性 沉淀法
有机溶剂变性 选择性酸碱变性
激光捕获显微切割技术（LCM）是在显微状态或显 微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、 细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、 分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的 显微分离收集技术。
2.3.1 LCM的特点
（1）LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的 特异细胞及细胞群。
4
ห้องสมุดไป่ตู้
梯度溶液的制备
理想梯度材料特点：
完全惰性，易分离
黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小
无腐蚀作用 易纯化，成本低 浓度便于测定 物理性质、热力学性质已知
梯度材料的应用
介质 DNA RNA 核蛋白 膜 细胞器 细胞 病毒
蔗糖
聚蔗糖 氯化铯 Percoll 碘化物
-+++ +
2.4 细胞的破碎
各种细胞破碎方法的应用范围
细胞破碎方法
机械法 研磨法 组织捣碎法（匀浆法） 物理法 反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法 化学与生物化学方法 自溶法 溶胀法 酶解法 温和 剧烈 温和 剧烈 剧烈 温和 温和 温和 温和 固体组织细胞、微生物细胞 固体组织细胞、微生物细胞 细菌细胞、组织培养细胞 悬浮细胞 微生物细胞、含有细胞壁的细胞 细菌细胞或病毒 组织及各种细胞 血细胞、组织培养细胞 植物细胞、细菌细胞、真菌细胞
非目的物变性沉淀
4
等电点沉淀法：利用具有不同等电点的良性电解质在达到中 性时溶解度最低，易发生沉淀的性质，从而实现分离的方法
5
有机聚合物沉淀法：早起应用于提纯免疫球蛋白 及沉淀一些细菌和病毒。近年来应用于核酸和酶
的纯化。
PEG沉淀解释： 聚合物与大分子发生共沉淀作用
亲水性强，生物大分子脱水
以氢键形成复合物，在重力作用下沉淀 空间位置排斥排斥
2.6.3 透析
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的 分离纯化技术之一，在生物大分子制备过程中，
除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓
缩样品等都要用到透析的技术。只需要使用专用 的半透膜即可完成。
2.6.4 超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力 下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜， 并使大分子溶质不能通过，留在膜一边，从而使大 分子物质得到了部分的纯化。 微孔过滤、超滤、反渗透
不动，载物台移动，激光逐点打到样品区
2. Laser Micro-Dissection 正置显微镜，紫外 激光束自动扫描切割样品边缘
LCM切割原理图
LCM实例与应用广泛应用于各种肿瘤研究
A：正常细胞;
B：腺瘤;
C：癌组织。 激光显微捕获大肠癌细胞
1：H&E染色(20倍放大);
2：LCM前Hematoxylin染色; 3：LCM后Hematoxylin染色; 4：切割下的上皮细胞。
存性
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
生物分析化学的样品制备 特点：
（1）生物样品的组成极其复杂
（2）许多生物分子的含量极微 （3）具有很宽的 动力学浓度范围 （4）提取制备过程中极易失活 （5）实验结果易受操作的影响
制备生物分子的基本原则：
（1）确定要制备的生物分子的目的和要求 （2）掌握目标产物的物理、化学及生物学性质
（4）各种物理性质—分子大小、穿膜能力、带点 情况、离心沉降表现
（5）化学性质—对各种化学试剂的稳定性
（6）对其他生物分子的亲和力
（7）在细胞内的定位等
分离纯化基本原理：
利用混合物中几个组分分配系数的差异 物理力场
2.2 生物材料的选择
生物材料来源于动物、植物和微生物及其代 谢产物，应尽可能选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的生物材料。
固相微萃取（SPME）是在固相萃取基础上 发展起来的一种新的萃取分离技术，具有操作时 间短、样品量小、无需萃取溶剂、适于分析挥发 性与非挥发性物质、重现性好等优点。
2.7.3 固相萃取的装置及操作程序
（1）活化吸附剂 操作 程序 （2）上样 （3）洗涤和洗脱
2.7.4 血清、血浆中高丰度蛋白的去除
蛋白质含量60-80mg/ml 10000种 目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和 柱色谱法和化学试剂除去法。
高丰度蛋白清除柱---混合床免疫亲和柱
2.7.5 固相微萃取
植物材料： 季节性、地理位置、生长环境
动物材料：年龄、性别、营养状况、遗传因 素、生理状态 微生物：菌种代数、培养基成分之间的差异
材料选定后加工处理： 动物组织：去结缔组织、脂肪、破碎细胞
植物：去壳、除脂
微生物：菌体与发酵液分开
生物材料-----冰冻保存
2.3 激光捕获显微切割技术
2.6.5 冰冻干燥
冰冻干燥是指将生物大分子的水溶液冰冻，然 后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的过
程。 特点：
样品不起泡、不沸腾 不黏壁、易取出 易溶于水
注意事项：
样品溶液 样品溶液的容器 溶液冰冻 冻干
2.7 固相萃取与固相微萃取
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将 液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基 体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱 或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物
固相萃取实质上是一种液相分离，故原则上讲，可
作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃
取中的吸附剂的选择主要根据目标化合物的性质和样品 基体性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似 时，可以得到目标化合物的最佳吸附。
选择分离模式和吸附剂：
溶解度 是否可能离子化 是否形成共价键 吸附点竞争度
1
离心力与相对离心力
离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任
务物体都受到一个向外的离心力进行的。 相对离心力（ relative centrifugal force，RCF）： RCF=F离心力/F重力
2
沉降系数、沉降速度、K系数
沉降系数S：
颗粒在单位离心力作用下的陈啊静速度称该颗粒的沉降系数。
++ +
+
+ +++
++
+ + +++
++
+ ++
+++
+
+++ ++ ++
++
++ ++ + ++
2.6.2 沉淀法
沉淀是溶质从溶液中析出的过程。 操作简便、成本低 原理：根据不同溶质在溶剂中溶解度不同从而 使其分离 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相。
中性盐的选择—硫酸铵 1
第二章 生物样品的制备
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
2.2 生物材料的选择
目 录
2.3 激光捕获显微切割技术
2.4 细胞的破碎
2.5 生物大分子提取 2.6 生物大分子的分离与纯化 2.7 固相萃取与固相微萃取
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
分析对象： 生物大分子----蛋白质、多肽、核酸、多糖 生物小分子----具有生物活性的小分子化合 物（内源性小分子、外源性小分子） 复杂性：组成、含量、动力学范围、时空依
有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采
用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼 有去除杂质、提高纯化效果的作用。
2.6 生物大分子的分离与纯化
2.6.1 离心技术 （centrifuge technique）
离心技术是根据颗粒在作迅速圆周运动时受到一
个外向的离心力的行为为发展起来的一种分离技术。 具有比较温和、分离样品量大等特点。
（2）利用显微切割技术实在组织细胞或染色体的原位
取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历 史背景明确。 （3）显微切割技术可以保证所取材料在一定层次上的 同质性。
在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。
K系数： 用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。
3
离心技术的分类
粗制品提取
1）差速离心法---不同粒子在离心力场沉降的差别 2）速率区带离心法---粒子在梯度液中沉降系数不同 3）等密度离心法---粒子颗粒密度不同
的目的。
2.7.1 固相萃取的模式及原理
固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其
主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、
反相、离子交换等几种类型。固相萃取所用的 吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同，只是 在粒度上有所区别。 吸附剂： 正向固相萃取 ---极性 反相固相萃取---非极性或极性较弱
2.7.2 固相萃取常用的吸附剂
剧烈程度
应用对象
2.5 生物大分子的提取
2.5.1 水溶液提取 盐浓度（离子强度） pH 影响 因素 温度 防止降解作用 搅拌与氧化
2.5.2 有机溶剂提取 对于一些难溶的蛋白质和酶，常用不同比例的有机 溶剂提取。 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。 有些蛋白质和酶既能溶于稀酸、稀碱，又能溶于含
中性盐沉淀 （盐析法）
盐析的操作方法—固体硫酸铵加入法
蛋白质的浓度
盐析的影响因素
pH 温度
基本原理：降低水溶液的介电系数 2
有机溶剂 沉淀法
有机溶剂的选择和浓度的计算—乙醇、甲醇、丙酮 V=V0(S2-S1)/(100-S2)
温度 样品浓度 pH 离子强度
影响因素
热变性 3
选择性变性 沉淀法
有机溶剂变性 选择性酸碱变性
激光捕获显微切割技术（LCM）是在显微状态或显 微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、 细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、 分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的 显微分离收集技术。
2.3.1 LCM的特点
（1）LCM可以从任何组织中快速、精确地分离出纯的 特异细胞及细胞群。
4
ห้องสมุดไป่ตู้
梯度溶液的制备
理想梯度材料特点：
完全惰性，易分离
黏度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小
无腐蚀作用 易纯化，成本低 浓度便于测定 物理性质、热力学性质已知
梯度材料的应用
介质 DNA RNA 核蛋白 膜 细胞器 细胞 病毒
蔗糖
聚蔗糖 氯化铯 Percoll 碘化物
-+++ +
2.4 细胞的破碎
各种细胞破碎方法的应用范围
细胞破碎方法
机械法 研磨法 组织捣碎法（匀浆法） 物理法 反复冻融法 超声波处理法 压榨法 冷热交替法 化学与生物化学方法 自溶法 溶胀法 酶解法 温和 剧烈 温和 剧烈 剧烈 温和 温和 温和 温和 固体组织细胞、微生物细胞 固体组织细胞、微生物细胞 细菌细胞、组织培养细胞 悬浮细胞 微生物细胞、含有细胞壁的细胞 细菌细胞或病毒 组织及各种细胞 血细胞、组织培养细胞 植物细胞、细菌细胞、真菌细胞
非目的物变性沉淀
4
等电点沉淀法：利用具有不同等电点的良性电解质在达到中 性时溶解度最低，易发生沉淀的性质，从而实现分离的方法
5
有机聚合物沉淀法：早起应用于提纯免疫球蛋白 及沉淀一些细菌和病毒。近年来应用于核酸和酶
的纯化。
PEG沉淀解释： 聚合物与大分子发生共沉淀作用
亲水性强，生物大分子脱水
以氢键形成复合物，在重力作用下沉淀 空间位置排斥排斥
2.6.3 透析
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的 分离纯化技术之一，在生物大分子制备过程中，
除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓
缩样品等都要用到透析的技术。只需要使用专用 的半透膜即可完成。
2.6.4 超滤
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力 下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜， 并使大分子溶质不能通过，留在膜一边，从而使大 分子物质得到了部分的纯化。 微孔过滤、超滤、反渗透
不动，载物台移动，激光逐点打到样品区
2. Laser Micro-Dissection 正置显微镜，紫外 激光束自动扫描切割样品边缘
LCM切割原理图
LCM实例与应用广泛应用于各种肿瘤研究
A：正常细胞;
B：腺瘤;
C：癌组织。 激光显微捕获大肠癌细胞
1：H&E染色(20倍放大);
2：LCM前Hematoxylin染色; 3：LCM后Hematoxylin染色; 4：切割下的上皮细胞。
存性
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
生物分析化学的样品制备 特点：
（1）生物样品的组成极其复杂
（2）许多生物分子的含量极微 （3）具有很宽的 动力学浓度范围 （4）提取制备过程中极易失活 （5）实验结果易受操作的影响
制备生物分子的基本原则：
（1）确定要制备的生物分子的目的和要求 （2）掌握目标产物的物理、化学及生物学性质
（4）各种物理性质—分子大小、穿膜能力、带点 情况、离心沉降表现
（5）化学性质—对各种化学试剂的稳定性
（6）对其他生物分子的亲和力
（7）在细胞内的定位等
分离纯化基本原理：
利用混合物中几个组分分配系数的差异 物理力场
2.2 生物材料的选择
生物材料来源于动物、植物和微生物及其代 谢产物，应尽可能选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的生物材料。
固相微萃取（SPME）是在固相萃取基础上 发展起来的一种新的萃取分离技术，具有操作时 间短、样品量小、无需萃取溶剂、适于分析挥发 性与非挥发性物质、重现性好等优点。
2.7.3 固相萃取的装置及操作程序
（1）活化吸附剂 操作 程序 （2）上样 （3）洗涤和洗脱
2.7.4 血清、血浆中高丰度蛋白的去除
蛋白质含量60-80mg/ml 10000种 目前，从血清中除去高丰度蛋白质的方法主要有亲和 柱色谱法和化学试剂除去法。
高丰度蛋白清除柱---混合床免疫亲和柱
2.7.5 固相微萃取
植物材料： 季节性、地理位置、生长环境
动物材料：年龄、性别、营养状况、遗传因 素、生理状态 微生物：菌种代数、培养基成分之间的差异
材料选定后加工处理： 动物组织：去结缔组织、脂肪、破碎细胞
植物：去壳、除脂
微生物：菌体与发酵液分开
生物材料-----冰冻保存
2.3 激光捕获显微切割技术
2.6.5 冰冻干燥
冰冻干燥是指将生物大分子的水溶液冰冻，然 后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉的过
程。 特点：
样品不起泡、不沸腾 不黏壁、易取出 易溶于水
注意事项：
样品溶液 样品溶液的容器 溶液冰冻 冻干
2.7 固相萃取与固相微萃取
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将 液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基 体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱 或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物
固相萃取实质上是一种液相分离，故原则上讲，可
作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃
取中的吸附剂的选择主要根据目标化合物的性质和样品 基体性质。目标化合物的极性与吸附剂的极性非常相似 时，可以得到目标化合物的最佳吸附。
选择分离模式和吸附剂：
溶解度 是否可能离子化 是否形成共价键 吸附点竞争度
1
离心力与相对离心力
离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任
务物体都受到一个向外的离心力进行的。 相对离心力（ relative centrifugal force，RCF）： RCF=F离心力/F重力
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沉降系数、沉降速度、K系数
沉降系数S：
颗粒在单位离心力作用下的陈啊静速度称该颗粒的沉降系数。
++ +
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2.6.2 沉淀法
沉淀是溶质从溶液中析出的过程。 操作简便、成本低 原理：根据不同溶质在溶剂中溶解度不同从而 使其分离 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相。
中性盐的选择—硫酸铵 1
第二章 生物样品的制备
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
2.2 生物材料的选择
目 录
2.3 激光捕获显微切割技术
2.4 细胞的破碎
2.5 生物大分子提取 2.6 生物大分子的分离与纯化 2.7 固相萃取与固相微萃取
2.1 生物分析化学分析对象的复杂性
分析对象： 生物大分子----蛋白质、多肽、核酸、多糖 生物小分子----具有生物活性的小分子化合 物（内源性小分子、外源性小分子） 复杂性：组成、含量、动力学范围、时空依
有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采
用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼 有去除杂质、提高纯化效果的作用。
2.6 生物大分子的分离与纯化
2.6.1 离心技术 （centrifuge technique）
离心技术是根据颗粒在作迅速圆周运动时受到一
个外向的离心力的行为为发展起来的一种分离技术。 具有比较温和、分离样品量大等特点。
（2）利用显微切割技术实在组织细胞或染色体的原位
取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究对象的历 史背景明确。 （3）显微切割技术可以保证所取材料在一定层次上的 同质性。