抗生素残留量检查法标准操作规程
抗生素类兽药残留检测技术
抗生素类兽药残留检测技术
1．技术简介
抗生素是微生物在代谢过程中的一种对其他微生物具有杀灭或抑制作用的次级代谢产物。抗生素的发现使人类掌握了治疗感染性疾病的有力武器，抗生素在兽医和畜牧业生产中均有大量应用，临床诊断用于呼吸系统、消化系统和生殖系统感染的治疗，大部分抗生素作为兽药添加剂用于动物疾病预防、降低死亡率和促生长。但抗生素存在耐药性、过敏和稳定性等问题，对人有毒害作用，因此是各国兽药残留监控的重要内容。
浓度（mg/kg） 变异系数CV（%）
≤1 35
1~10 30
10~100 20
≥100 5
b．准确度：指测定值与真实值的接近程度，通常采用添加回收率来表示。定量方法的回收率范围应为79~110%，平均回收率80%以上。以下数据可供参考：
2．应用条件
抗生素残留检测属复杂的痕量组分分析技术，多数残留水平为1ug/Kg~1mg/Kg，对检测条件及仪器设备要求都极高，从事此项工作的机构一般都配有气相色谱、液相色谱、质谱以及灵敏度更高的多级质谱，这些仪器的价格都非常昂贵。实验室环境要好，避免与外界环境间的交叉污染。检验人员要有较高的素质，有深厚的现代化学背景知识，实验技能强，具有分析问题和解决问题的能力。这些都是从事检测工作所必需的。
c．检测限（LOD）与定量限（LOQ）：
一般要求：LOD≤0.1MRL（最大残留限量）
LOQ≤0.2MRL
d．线性范围
e．选择性
抗生素种类很多，目前发现的有上千种，常见的抗生素主要包括以下几大类：
（1）β-内酰胺类：包括青霉素类、头孢氨苄（先锋霉素IV）、头孢、庆大霉素、新霉素、壮观霉素等。
3．操作规程
蜂王浆中四环素类抗生素残留量测定方法(一)
蜂王浆中四环素类抗生素残留量测定方法（一）1 范围本标准规定了蜂王浆中四环素类抗生素残留的发射受体分析(Charm Ⅱ)办法。
本标准适用于蜂王浆中、、、强力霉素抗生素残留总量的测定。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不行少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括全部的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析试验室用水规格和实验办法 3 办法提要发射受体分析(Charm Ⅱ)办法的基础是药物功能团与微生物受体位点的结合反应，这些位点与某一类种抗生素的共有功能团相关。
应用受体的这种特异性可以实现对某一类抗生素的多残留分析。
本办法中，样品中残留的四环素类药物经提取、稀释后与[3H]标志的金霉素共同竞争结合特异的受体位点。
在一定温度下反应后，离心分别，清除未结合的四环素类药物，最后加人闪耀液，测定[3H]衰变发出的β粒子发射性量值，计数cpm(count per minute)。
测得的cpm值与样品中四环素类抗生素残留量成反比。
4 试剂和材料除另有解释外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 四环素类检测试剂盒： 4.1.1 组织阴性对比浓缩干粉：组织阴性对比浓缩干粉储存于2℃～6℃。
4.1.2 MSU多抗标准品浓缩干粉：浓缩干粉储存于2℃～6℃。
4.1.3 组织萃取缓冲溶液(MSU萃取缓冲溶液)干粉：储存于2℃～6℃。
4.1.4 M2缓冲溶液干粉：用于调整pH值，储存于2℃～6℃。
4.1.5 四环素类受体药片：白色，-15℃以下的条件保存。
4.1.6 四环素类氚标志药片：橙色，-15℃以下的条件保存。
4.2 组织阴性对比溶液：用法时取组织阴性对比浓缩干粉(4.1.1)按试剂盒解释书配制成阴性对比溶液。
配制好的溶液可在2℃～6℃冰箱或冰浴中保存48 h。
如长时光不用，可将溶液保存于-15℃以下的冰箱中，用法时将其解冻。
SOP-QC--00 盐酸克林霉素残留限度检验测定标准操作规程
目 的：建立盐酸克林霉素残留限度的检验标准操作规程。
范 围：适用于盐酸克林霉素残留限度检验的标准操作。
职 责：QC 负责盐酸克林霉素残留限度的检验。
内 容：1 测定内容1.1 仪器与用具高效液相色谱仪、量筒、容量瓶。
1.2 试剂与试药盐酸克林霉素对照品、色谱甲醇、磷酸氢二铵、磷酸。
1.3 操作方法色谱条件与系统适用性试验 用十八基键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢铵溶液（取磷酸二氢铵2.88g ，加水溶解并稀释成1000ml ，用80%磷酸溶液调节pH 至3.0）-甲醇（210：300）为流动相；检测波长214nm ，流速为1ml/min ；理论板数按克林霉素峰计算应不低于1300，按外标法以峰面积计算含量。
对照品溶液的制备 取盐酸克林霉素对照品适量，加流动相溶解使制成含克林霉素为5μg/ml 的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 取设备清洁水（或取已清洁后擦拭过的棉球加入5ml 流动相超声5mim ），作为供试品溶液。
测定法 精密量取供试品溶液和对照品溶液各20µl ，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。
1.4 结果判定 盐酸克林霉素残留限度检验标准操作规程文件编码：SOP －QC －版本号：00 制订人：制订日期： 会稿人：审核人：审核日期： 批准人：批准日期： 起草部门：质量控制部颁发部门：质量保证部 生效日期： 复印份数 共 份 受控号： 分发部门 □质量保证部、□质量控制部、□人力行政部、□设备工程部、□物控部、□仓储、□研发部、□生产技术部、□固体车间、□口服液车间、□洗剂车间、□提取车间、□冻干粉针车间、□生化提取车间淋洗法含克林霉素≤6.09μg/ml、擦拭法含克林霉素≤8.05 μg/ml（以具体设备清洁验证方案要求为准），则符合规定。
2 相关记录2.1盐酸克林霉素残留限度检验记录3 变更明细表序号章节变更内容变更日期变更编号现版本号。
畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法
畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法1主题内容与适用范围本标准规定了畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的检测方法。
本标准适用于各种畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定。
最低检出浓度为:0.15，0.20，0.65mg/kg。
2原理样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分别，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。
标准加法定量。
3试剂3.1乙腈(分析纯)。
3.20.01mol/L磷酸二氢钠溶液:称取1.56g(±0.01g)磷酸二氢钠(NaH2PH4·2H2O)溶于蒸馏水中，定容到100mL，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，备用。
3.3土霉素(OTC)标准溶液:称取土每素0.0100g(±0.0001g)，用0.1mol/L盐酸溶液每毫升含土霉素1mg。
3.4四环素(TC)标准溶液:称取四环素0.0100g(±0.001g)，用0.01mol/l盐酸溶液溶解并定容10.00mL，此溶液每毫升含四环素1mg。
3.5金霉素(CTC)标准溶液:称取金霉素0.0100g(±0.0001g)，溶于蒸馏水并定容成10.00mL，此溶液每毫升含金霉素1mg。
以上标准品均按1000单位/mg折算。
3.3～3.5溶液应于4℃以下保存，可使用1周。
3.6混合标准溶液:取3.3、3.4标准溶液各1.00mL，取3.5标准溶液2.00mL，置于10mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
此溶液每毫升含土霉素、四环素各0.1mg，金霉素0.2mg，临时现配。
3.75%高氯酸溶液。
4仪器4.1高效液相色谱仪(HPLC):具紫外检测器。
5色谱条件5.1柱:ODS-C18(45μm)6.2mm×15cm。
5.2检测波长:355nm。
5.3灵敏度:0.002AUFS。
5.4柱温:室温。
5.5流速:1.0mL/min。
5.6进样量:10μL。
全国临床检验操作规程第四版抗生素残留标准(一)
全国临床检验操作规程第四版抗生素残留标准(一)
全国临床检验操作规程第四版抗生素残留标准
引言
•全国临床检验操作规程第四版抗生素残留标准是临床实验室必须遵循的规范。
•本文将介绍该操作规程的背景、目的和实施要求。
背景
•抗生素广泛应用于临床治疗，但合理用药的重要性也逐渐受到重视。
•抗生素残留的存在会对患者的健康产生潜在威胁。
•制定全国临床检验操作规程第四版抗生素残留标准旨在规范临床实验室的操作流程，保障患者用药安全。
目的
•确保临床实验室准确、快速地检测抗生素残留。
•提高实验室人员的专业水平和操作技能，减少操作误差。
•保证抗生素残留检测结果的准确性和可靠性，以指导临床合理用药。
实施要求
•实验室人员必须经过专业培训，并具备相应资质。
•实验室必须配备先进的检测设备和仪器。
•操作过程中要注意标本采集、样品储存和标准曲线的建立。
•严格遵循操作规程进行样品处理、抗生素残留检测和质量控制等操作。
•结果分析和报告必须符合相关要求，且及时准确。
结论
•全国临床检验操作规程第四版抗生素残留标准的制定将提高抗生素残留检测的质量和效率。
•实施该操作规程有助于保证患者用药的安全性，并提高临床治疗的质量。
抗生素检测方法
抗生素检测方法
1、取100ml样品（称取62.5g乳粉定溶至500ml，溶解，从中取100ml 样品）于250ml三角烧瓶内,记录样品号。
2、加热杀菌
将样品放在电炉上加热煮沸1分钟。
3、冷却、接种
用硅胶塞封口，置于冷水浴中（注意不要使奶液流动触及封口塞），使奶温降至43℃，用天平称取3g发酵菌种(预制)加入盛有奶样的三角瓶内。
摇动三角瓶，使发酵菌种与奶液混合均匀。
4、恒温发酵
将该批奶样置于已恒温至43℃的培养箱中进行发酵。
5、观察
恒温培养3小时后即可观察奶样。
取出样品，摇动三角烧瓶，观察凝固状态，并测定滴定酸度。
如酸度≥50。
T，则表明样品质量良好，抗生素阴性；如酸度＜50。
T，表明原料奶中有抗生素残留，抗生素阳性。
家禽肉中残留抗生素的定量检测
家禽肉中残留抗生素的定量检测一、引言家禽被广泛地饲养于人工环境中，肉品提供者（如养户等）常用抗生素预防或治疗身体不适，这就导致许多家禽肉中残留了抗生素。
因此，定量检测家禽肉中残留抗生素就变得非常必要。
二、抗生素残留检测方法常用的抗生素残留检测方法有微生物学法、物理化学法及免疫学法。
其中，微生物学法是基于杀菌剂能影响微生物生长的原理，常用的有生物成分法、纸片扩散法和碟片扩散法。
物理化学法是主要基于色谱分析和光学方法，如高效液相色谱法和三维荧光光谱法。
免疫学法是利用特异性抗体对目标物质进行检测，火灾快速检测方法就是这一类的方法。
三、抗生素残留检测的原理抗生素检测的原理主要基于化学分析，通过化学方法将样品中的目标分子提取出来，然后使用比例色谱法分离目标分子，测量目标分子的含量，从而得到答案。
另外，检测一般还会通过人工复核，以确保结果的准确性。
四、流行抗生素残留标准我国《食品安全国家标准：家禽肉中药物残留限量》中规定，家禽肉中常用的氨基糖苷类、头孢菌素、氟喹诺酮类等抗生素的残留限量。
家禽肉中药物残留超标已被认为是威胁食品安全的一种因素，因此各种法律和规章制度都严格限制了抗生素的使用和监管。
五、抗生素残留问题的解决为了更好地保障食品安全，解决食品安全问题，我们需要采取如下措施：1. 防止抗生素滥用。
2. 严格监管养户、饲养的生产过程，以减少抗生素的使用。
3. 使用替代性方法来预防疾病，如光照和化学预防等。
六、结论抗生素残留带来的问题在食品安全中占有重要地位，我们有责任保障人们的健康，改善消费者的生活质量。
需要从源头上预防问题的发生，加强监管力度，掌握科学的消化技术，推广科学养殖方式，加强企业社会责任和监督执法力度，在食品安全方面不遗余力，确保国民的健康。
牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定步骤
牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量测定步骤(1)液相色谱测定条件色谱柱： Kromasil 100-5C18，5 μm，150 mm×4.6 mm(内径)或相当者；流淌相： 0.01 mol/L溶液-～(77+18+5，v/v/v)；流速： 1.0 mL/min；柱温： 40℃；检测波长： 350 nm；进样量：60 μL。
(2)液相色谱测定将混合标准工作溶液分离进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品举行定量，样品溶液中、、、的响应值均应在仪器测定的线性范围内。
在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时光分离为3.09 min、3.73 min、8.27 min和12.53 min。
土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图见图12-11。
图12-11 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图12.2.5.7 分析条件的挑选 (1)提取条件的挑选四环素类抗生素分子含有若干亲水的羟基，易溶于水和较低级的伯醇类，在中性和酸性溶液中较稳定。
在pH 3～8的范围内离子化，在pH3左右以阳离子形式存在，在pH 7.5以上时以阴离子形式存在。
可与二价、三价金属离子阳离子螯合。
牛奶中含有丰盛的蛋白质和钙，影响四环素抗生素的提取。
采纳了20%、-亚铁氢化钾体系、乙腈等作为蛋白沉淀剂，虽然蛋白沉淀效果较好，但回收率均较低。
用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取，并在较低温度下离心，可以起到沉淀蛋白的作用，并掩蔽二价阳离子Ca2+和Mg2+的干扰，可以获得较为惬意的回收率，因此选用pH 4.0的Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液为提取液。
(2)净化条件的优化在试验中，对照了WCX、Oasis HLB单-固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱加羧酸型阳离子交换柱双柱合用的效果。
试验发觉，WCX柱净化效果不好且回收率低。
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抗生素残留量检查法标准操作规程
目录
1 目的 (2)
2 范围 (2)
3 职责 (2)
4 依据 (2)
5 定义 (2)
6 内容 (2)
6.1 说明............................................................................................... 错误！未定义书签。
6.2 原理 (2)
6.3 实验材料 (2)
6.4 操作步骤 (3)
6.5 判定标准 (3)
6.6 注意事项 (4)
7 相关文件 (4)
8 附件 (4)
9 变更历史记录 (4)
1目的
1.1本规程规范了抗生素残留量检查法的操作过程。
2范围
2.1本规程适用于供试品中氨苄西林的残留量检查。
3职责
3.1质量检验人员：应严格执行本规程的规定。
3.2质量保证人员：负责对本程序的执行进行监督、检查。
4依据
4.1《中国药典》2010年版三部，附录ⅨA，“抗生素残留量检查法”P59~P60。
5定义
N/A
6内容
6.1原理
6.1.1抗生素残留量检查法是依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品
与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中抗生素的残留量。
6.2实验材料
6.2.1仪器
6.2.1.1生物安全柜
6.2.1.2恒温培养箱
6.2.1.3恒温水浴锅
6.2.1.4游标卡尺
6.2.2器具
6.2.2.1牛津杯规格：内径6mm、外径8mm、高10mm 6.2.2.2玻璃平皿规格：直径约90mm
6.2.2.3试管及硅胶塞规格：18×180mm
6.2.2.4吸管规格：10ml
6.2.3标准物质
6.2.3.1取氨苄西林对照品适量，用0.01mol/L的盐酸溶解，并稀释成每1ml中含氨苄西林
10mg的溶液，作为氨苄西林对照品储备液，200ul/支无菌分装，-20℃保存，备用。
6.2.4试剂、试液
6.2.4.1磷酸盐缓冲液（pH6.0）
●称取磷酸二氢钾8.0g、磷酸氢二钾2.0g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃灭菌
30分钟。
6.2.4.2抗生素II号培养基：
●称取蛋白胨6g、牛肉提取粉1.5g、酵母浸出粉6g，加入适量水溶解后，加入琼脂13～
14g，加热使之溶胀，滤过除去不溶物，加入葡萄糖1g，溶解后加水至1000ml，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6；分装于玻璃管或锥形瓶中，经115℃灭菌30min，4℃保存。
6.2.4.30.01mol/L盐酸溶液：
●取9ml浓盐酸，加纯化水至1000ml，混匀即得0.1mol/L的盐酸溶液，临用前取10ml
加纯化水稀释至100ml，混匀即得。
6.2.5实验菌种：
6.2.5.1金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
6.3操作步骤
6.3.1对照品溶液的制备
6.3.1.1取氨苄西林对照品储备液1支，用磷酸盐缓冲液稀释成每1ml中含1.0ug的溶液。
6.3.2菌悬液的制备
6.3.2.1取金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，35℃~37℃培养
20~22小时。
临用前，用适量的灭菌水将菌苔洗下，备用。
6.3.3底层培养基制备
6.3.3.1取直径约90mm的培养皿，注入已融化的抗生素Ⅱ号培养基约15~20ml，使在平皿内
均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层（临用前制备）。
6.3.4菌层制备
6.3.4.1取抗生素Ⅱ号培养基10~15ml置于1支50℃水浴预热的试管中，加入适量浓度的菌
悬液300μl，混匀，注入已铺好底层的培养皿中，放置水平台上，冷却。
6.3.5加样
6.3.5.1在培养皿上等距离均匀放置牛津杯，向牛津杯中依次加入供试品溶液、阴性对照溶液
（磷酸盐缓冲液）及对照品溶液。
各200μl，将加好样的培养皿置37℃培养18~22小时。
6.4判定标准
6.4.1实验成立判断标准
6.4.1.1对照品溶液应有抑菌圈，阴性对照溶液应无抑菌圈，否则判定实验无效。
6.4.2供试品检测结果判断标准
6.4.2.1供试品溶液不应有抑菌圈出现，否则判定为不符合规定。
6.5注意事项
6.5.1本实验应在无菌条件下进行，在生物安全柜内操作，使用的玻璃仪器、牛津杯等应无
菌。
6.5.2供试品溶液一般指待测原液自身，除另有规定外，不作其它处理。
7相关文件
名称编码
8附件
附件附件名称附件编码版本号
9变更历史记录
文件编码生效日期版本号变更原因
变更内容提要：
抗生素（氨苄西林）残留量检查记录品名
批号/编号请验日期
规格请验部门
检验日期检验依据
1实验材料
1.1仪器与用具
名称型号设备编号
1.2标准物质
名称来源规格/含量批号/编号
1.3试药与试液
名称来源批号
1.4实验菌种
名称编号代数
2操作步骤
2.1对照品溶液的处理
2.2菌悬液的制备
2.2.1取金黄色葡萄球菌琼脂斜面培养物，用ml 灭菌水将菌苔洗下，备用。
2.3底层的制备
2.3.1取直径90mm培养皿，注入融化的抗生素Ⅱ号培养基15~20ml，使在平皿内均匀摊布，放置水平台
上使凝固，作为底层。
2.4菌层的制备
2.4.1取10~15ml抗生素Ⅱ号培养基置于1支50℃水浴预热的试管中，加入适量浓度的菌悬液300μl，混
匀，注入已铺制底层的培养皿中，放置水平台上使凝固。
2.5加样
2.5.1在培养皿上等距离均匀放置牛津杯，并于牛津杯中依次滴加ul供试品溶液、阴性对照溶
液（磷酸盐缓冲液）及对照品溶液。
将培养皿置于℃培养小时后观察。
3结果分析
对照品抑菌圈直径为：；供试品抑菌圈直径为：；阴性对照抑菌圈直径为：；
4结果判定
4.1标准规定：
□对照品溶液应有抑菌圈，阴性对照溶液应无抑菌圈，则实验成立；供试品溶液应无抑菌圈。
4.2检验结果：
4.2.1实验是否成立：□成立□不成立
4.2.2供试品溶液抑菌圈。
4.3检验结论：
4.3.1□符合规定□ 不符合规定□ N/A
5备注
5.1附氨苄西林残留量检查照片，共页
5.2。