解读2020药典热原检查法
药典规定的检测热原质的方法
药典规定的检测热原质的方法
中国药典《中药炮制规范》（2015年版）检测热原质的方法如下：
1. 使用原料重量计算热原质的含量：取指定数量的原料，将其称量，根据热原质的含量与总重量的比值提出热能值。
2. 采用TT热量计法测定热量：采用预定数量的原料制备滴定液，将滴定液室内温度稳定后，使用TT热量计用水和饱和溶液分别作为常温热容和滴定热容，测量两测量间温度变化，从而推算出热容及热量。
3. 采用微量热容计法测定热量：取指定数量的原料，放入小容器中，室内温度稳定后，使用微量热容计测量溶液公分母的温度的变化，从而推算出溶液的热量。
4. 运用全热分析法测定热量：将指定数量的原料制备成气悬浮液，在室内温度稳定后，使用全热分析仪测量悬浮液热容，然后推算出迭热及热量。
热原检查法
热原检查法中国鲎成为了国家二级保护动物, 鲎试剂成为了紧俏资源。
作为一个注射剂制药企业的QC, 不得不考虑以后怎么来应对, 除了采用减少鲎试剂的用量外, 可选择重组鲎试剂或采用重组C因子法, 但结果的等效性研究这个拦路虎很难打到。
百无聊赖就翻开了《中国药典检测分析指南》2017年版的热原检查法, 开卷有益, 该版指南对人员检查的基本原理等进行了全面的阐述, 现将学习内容进行总结。
1.热原相关的定义及来源1.1 相关定义热原是注射进入人体或动物体内后, 能导致其体温升高的一类物质的总称。
可以直接导致体温升高的物质称为外源性热原, 由外源性热原引起体内产生的致热物质称为内源性热原。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LPS）。
当细菌死亡或自溶后便会释放内毒素。
LPS是高分子量的脂多糖。
思考: 以上定义解释了注射剂为什么要进行热原检查或细菌内毒素检查。
1.2 热原的致热原理外源性物质进入人体, 作用到单核细胞系统, 刺激其分泌内源性致热原[主要有白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1（IL-1）干扰素（INF）及肿瘤坏死因子（TNF）等]；内源性致热原作用于下丘脑提问调节中枢, 使体温调定点上调, 造成产热增加、散热减少, 导致人体发热。
思考: 干扰素、抗肿瘤药物等是否会影响热原的检查？1.3 外源性热原的来源1.3.1 外源性热原中微生物来源的包括:a) 革兰氏阳性菌细菌成分（脂阿拉伯甘露聚糖、蛋白、热休克蛋白A.脂磷壁酸等）；b) 革兰氏阴性菌细菌成分（脂质A.外膜蛋白、膜孔蛋白、陪伴蛋白等）；c) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞壁成分（细胞表面蛋白、菌毛、脂肽、脂蛋白、肽聚糖、胞壁酰二肽等）；d) 革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌细胞外成分（毒素、超抗原等）；e) 非细胞性微生物（活病毒、真菌、酵母、疟原虫等）。
微生物产生的致热物质中, 革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素致热性最强, 其次是革兰氏阳性杆菌, 革兰氏阳性球菌致热作用较弱, 真菌、病毒致热作用更弱, 因此, 细菌内毒素被认为是自然界最强致热原。
周建平-药品热原检查与细菌内毒素检查方法介绍
2020/8/4
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实验兔重复使用
1、结果符合规定的实验兔，休息48hr 2、复试用兔升温＜0.6℃且供试品合格，休息48hr 3、使用次数未达10次的实验兔 4、复试用兔升温≥0.6℃且供试品合格，按新兔测温合
格
（以上实验兔可重复使用）
5、结果不符合规定的实验兔 6、使用次数达10次的实验兔
2020/8/4
28
标准内毒素
标准内毒素： 指经人工提取精制并经生物效价
测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检查的
标准品。
国际标准品（IS）
标准品
（RSE）
国家标准品（RSE）
标准内毒素
工作标准品 （CSE）
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细菌内毒素的量值
➢ 80年代以前以重量作为内毒素的单位 ➢ 1982年USP20引入以生物效价为量值的
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实验动物
动物品系：均为远交系动物，普通级饲养。日本大 耳白（Japanese White），新西兰白（New Zealand White），青紫蓝，比利时白（Belgian White），Chinchillas 和 Dutch Belts
要求：健康合格、1.7～3.0kg、同一来源和品系。 性别:雌雄均可。雌性动物，比较温顺，易于捉持，
药品热原检查与细菌内毒 素检查方法介020/8/4
1
药品安全性检验内容
热原检查（Pyrogen Test) 细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxin Test） 异常毒性检查 降压物质检查 过敏法反应检查法 降钙素生物测定法 生长激素生物测定法 溶血与凝聚检查法
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药典规定的检测热原质的方法
药典规定的检测热原质的方法1. 微生物法：微生物法是药典规定的一种常用的检测热原质的方法。
该方法是通过观察热原质对微生物的生长和繁殖的影响来判断样品中是否含有热原质。
药典通常使用大肠杆菌（Escherichia coli）或鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）等细菌来进行测试。
具体的方法是将待检样品与细菌培养基混合，观察一定时间后，观察细菌的生长情况。
如果待检样品中存在热原质，就会抑制细菌的生长，从而判断样品中存在热原质。
2.物理法：物理法是药典规定的另一种常用的检测热原质的方法。
该方法是通过测量待检样品的热效应来判断样品中是否含有热原质。
药典中常用的物理法包括热量计法和热成像法。
热量计法是使用热量计来测量待检样品在加热或反应过程中产生的热量，如果样品中存在热原质，就会产生明显的热效应。
热成像法是使用红外热像仪来观察样品在加热或反应过程中的温度变化，如果样品中存在热原质，就会在红外热像仪上显示出明显的热点。
3.化学法：化学法是药典规定的另一种常用的检测热原质的方法。
该方法是通过化学反应来判断样品中是否含有热原质。
药典中常用的化学法包括直接显色法和间接显色法。
直接显色法是将待检样品与其中一种试剂直接混合反应，如果样品中存在热原质，则会产生明显的颜色变化。
间接显色法是将待检样品与其中一种试剂混合反应后，再加入其他试剂观察颜色变化，如果样品中存在热原质，则会产生明显的颜色变化。
药典规定的上述方法在检测热原质方面具有可靠性和准确性，被广泛应用于药物制剂的质量控制和检测中。
但需要注意的是，不同药典对于检测热原质的方法可能会有一些差异，具体的检测方法应根据具体的药典要求进行操作。
另外，在实际操作中也应注意正确选择适用的方法，并且保证实验操作的准确性和标准化，以获得可靠的检测结果。
药品的安全性检查-热原
热原
二、家兔检查法
3只兔：0.5小时测1次，共6次， 最高-最低＝升高的温度 结果：均升高在0.6℃以下 且升高的总数在1.3℃以下 认为符合规定。
药品的安全性检查——热原
热原
一、基本知识
（一）基本概念 热原(pyrogen)系指药品中含有的能引起体温升高的杂质，
主要为细菌性热原。 方法：家兔检查法，即将一定剂量的供试品，静脉注入家
兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限量是否符合规定。 （二）检查对象
供静脉滴注用的注射剂以及容易感染热原的品种。
执业药师考试药剂学辅导：热原检查法
执业药师考试药剂学辅导:热原检查法 (⼀)家兔发热试验法 热原检查⽬前各国药典法定的⽅法仍为家兔发热试验法，属限度试验。
它是将⼀定量的供试品，由静脉注⼊家兔体内，在规定时间内观察体温的变化情况，如家兔体温升⾼的度数超过规定限度即认为有热原反应。
具体试验⽅法和结果判断标准见《中国药典》(2000年版)⼆部附录。
本法结果准确，但费时较长、操作繁琐，不利于连续⽣产。
(⼆)鲎试验法 本法操作简单、结果迅速可得、灵敏度⾼。
但本法对⾰兰⽒阴性以外的内毒素不敏感，故还不能完全代替家兔发热试验法。
常⽤于某些不能⽤家兔进⾏热原检测的品种，如放射性药剂等;也适⽤于⽣产注射药品时，检测中间产品是否污染热原。
原理是利⽤动物鲎的变形细胞溶解物与引起热原反应的细菌内毒素之间可产⽣的凝胶反应，从⽽定性或定量地测定此内毒素。
测定⽅法：取4⽀⽆菌、⽆热原带塞玻璃试管放于37℃⽔浴中，向每⽀试管中加⼊0.2ml鲎试剂。
向第1⽀试管内加⼊0.9%nacl液0.2ml，作阴性对照管，此管应⽆凝胶⽣成(因⽆热原不应有凝胶⽣成);向第2⽀试管内加⼊0.9%nacl与0.05µg/ml标准内毒素混合液0.2ml，作阳性对照管，30分钟应出现稳定的凝胶(试管倒转180度，凝胶固定不变)，说明鲎试剂有效;向第3⽀试管内加样品溶液与0.05µg/ml标准内毒素混合液0.2ml作假阳性对照管，30分钟应出现稳固的凝胶，说明供试品内不致有⼲扰物质存在;向第4⽀试管内加⼊检品溶液0.2ml，30分钟后若⽆凝胶⽣成，证明检品中⽆热原存在。
操作时⼀般可将试管倾斜45度观察，如含有热原，多在20分钟就出现阳性反应，同时还须注意如温度、ph值及沉淀剂等对鲎试剂的⼲扰作⽤。
中国药典2020无菌检查法
中国药典2020无菌检查法【原创版】目录1.概述2.检查法内容3.实施方法4.注意事项5.结论正文1.概述《中国药典 2020》是我国药品行业的权威标准，对药品的研发、生产、质量控制以及药品的审批上市等环节具有重要的指导意义。
其中，无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，它关乎到药品的安全性和有效性。
本文将对《中国药典 2020》中的无菌检查法进行详细解读。
2.检查法内容无菌检查法主要包括以下内容：（1）检查原理：通过检测样品中微生物的数量，判断样品是否符合无菌要求。
（2）检查方法：包括直接涂片法、薄膜过滤法等。
（3）检查标准：根据药品的类型和用途，规定了不同的无菌标准。
例如，注射剂要求无菌，而口服制剂则要求微生物限度符合标准。
3.实施方法在实施无菌检查时，需要遵循以下步骤：（1）样品的采集和处理：采集样品，进行适当的处理，如灭菌、稀释等，以保证检查结果的准确性。
（2）检查操作：根据选定的检查方法，进行无菌检查。
例如，直接涂片法是将样品涂抹在培养基上，观察培养基上是否有微生物生长；薄膜过滤法是将样品通过薄膜过滤器，然后将滤膜在培养基上进行培养，观察培养基上是否有微生物生长。
（3）结果判定：根据检查结果，判断样品是否符合无菌要求。
4.注意事项在进行无菌检查时，需要注意以下几点：（1）采样：采样应具有代表性，以保证检查结果的准确性。
（2）器具：检查过程中使用的器具应严格灭菌，防止外源性微生物的污染。
（3）环境：检查环境应符合无菌要求，避免环境中的微生物对检查结果的影响。
（4）结果判定：结果判定应严格按照标准进行，避免主观判断导致的误差。
5.结论无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，对保证药品的安全性和有效性具有重要意义。
《中国药典 2020》对无菌检查法进行了详细的规定，为药品企业和研究机构提供了明确的指导。
2020版《中国药典》药包材—热原检查法公示稿
提取比例（表面积或质量/体积）±10%
≤0.5
6cm2/ml
0.5~1.规则形状
0.2g/ml
表2提取条件
提取温度（℃）
提取时间（h）
37±1
24±2
37±1
72±2
50±2
72±2
70±2
24±2
121±1
1±0.1
检查法取供试品液，照热原检查法（中国药典四部通则1142）进行试验和结果判断，应符合要求。
干。除另有规定外，切成0.5cm×3cm条状，不计算因分割而产生的表面积增加。由于完整表面与切割表面可能存在潜在的提取性能差异，必要时可保持供试品的完整性。除另有规定外，供试品置高压灭菌器内115℃保持30分钟。照下列表1和表2方式制备供试品液。供试品液应在制备后2h内使用。
表 1 供试品表面积或质量与提取介质体积的比例
附件
热原检查法
本法系将供试品液静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
试验动物：应符合热原检查法（中国药典四部通则1142）中供试用家兔的规定。
试验前的准备：应符合热原检查法（中国药典四部通则1142）中试验前准备的规定。供试品液制备：制备过程应按无菌操作法进行。将供试品用纯化水冲洗干净，用滤纸吸
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说到热原检查，我们先了解几个概念，热原、热原反应、内毒素、实验动物。
热原（p yr o g e n）：指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
注射液中的热原主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。
致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。
热原反应：临床上在进行静脉滴注大量输液时，由于药液中含有热原，病人在0.5～1h内出现冷颤、高热、出汗、昏晕、呕吐等症状，高热时体温可达40℃，严重者甚至可休克，这种现象称为热原反应。
细菌内毒素：是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。
因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。
如自来水中含内毒素的量为1至100E U/m l。
当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。
注射液中如果含有内毒素，就会产生代谢产物，内毒素大量进入血液就会引起发热反应即热原反应。
因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。
由于家兔对热原的反应与人基本相似，对热原比较敏感，所以半个世纪以来一直用家兔来检测热原，家兔为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。
鲎试验在某些情况下，比如西药注射液、生理盐水等成分明确的药品，现在大多采用鲎试验来检测，但在一些中药注射剂、血液制品，抗毒素等由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，还在使用兔法来检测热原，因此鲎试验目前还无法完全取代家兔热原试验。
检查法药典要求一
雌兔应无孕，家兔怀孕了会出现腹围会变大，体重也会增大，情绪变得多变，在试验固定台上不容易固定，怀孕后温度波动也会变得不敏感，药物反应小，影响检验结果的准确性。
新兔使用前要预测体温，有的兔子本身体温就低，不符合试验要求，要挑出来，也有运动健将型的，在试验台上固定着老是动来动去的，由于运动频繁体温也自然升高，一旦注射药物，有时候会出现假阳性可能。
有疾病的动物也不能使用，这些有病的动物可能本身就在发烧，如果注射药物后体温会降下来，就是药物发挥了治疗作用或急据升高，加重病情，总之不确定性太多，所以我们要选择体重合格、体温合格、精神状态好的。
大概的选择依据是这样的，兔身体匀称，肌肉结实丰满，背毛光滑。
对外界反应表现出很机灵的样子。
食欲旺盛是家兔健康的表现，粪便呈球形或椭圆形，大小均匀，外表光滑圆润，松散均匀，呈黑褐
色，新鲜粪便略带光泽。
试验前的体温预测（正常体温范围、温度波动）应符合药典规定。
检查法药典要求二
热原试验对环境的要求，饲养环境的试验环境温度应保持一致，我们做热原试验一般普通环境就能满足要求，药典所要求的也是普通环境的温度，相当于医药洁净区的温度，家兔长时间生活在一个相对恒温的环境中，也有助于保证检验结果的准确性。
试验前禁食是这是为了降低由于饮食后导致的新陈代谢加快，体温升高，影响结果。
本来动物试验就有很多不确定因素，我们所做的一切也是为了降低不确定度，增加检结果的准确度。
检查法药典要求三
测温装置的要求，药典统一要求为插入直肠深度为6c m，这种说法太过严格，药典并未对体重都没有统一要求，没有要求体重一致，药典要求体重为1.7k g以上，那么1.7k g和3.0k g休重，差了接近一倍了，为什么要对测温仪的插入深度做统一规定呢？
对于体型中等的兔子（一般2.2-2.5k g为试验最佳体重），插入直肠6c m正合适，对动物的刺激也最小，但对于体重大的和体重小的，就有些矫枉过正了，对体型小的兔子，6c m的深度太长，对动物的的刺激过大，引起动物不安，对于体型大的来说，6c m的深度又浅了，测量温度会略低于动物的实际体温，导致升温不显著。
因此插入深度应因兔而异，即不影响检验结果又对动物伤害小，这是我们的原则，关爱人类的同时，人们也要保护动物。
检验结果的判定，这两版药典都没怎么变化过，本文就不做讨论了。
以上就是笔者对中国药典的热原检查法的一点个人观点，不周之处，请提出您的意见，互相学习共同提高。