08 免疫组化双重染色技术汇总
免疫组化4双重或多重标记
；
4. 保证试剂的清洁度与纯度 ( 双蒸水，亲和
免疫层析 ) ，注意增强组织片与载玻片的粘
合 度 ， 以 减 少 脱 片 机 率 ；
5. 封片剂选择应注意显色剂的溶解特性，
一般多采用水封片(10%缓冲甘油)，保存时
间不长，应及时观察记录。
反应。可视预实验结果来确定。
（三）双重及多重免疫金标记(电镜） 电镜下的双重免疫标记染色不是靠
颜色区分，而是靠标记物的不同电子密
度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，
有别于光镜下的双重免疫标记方法。
常用的方法多为双重免疫金标记 优点：高电子密度，分辨率高，抗原定 位精确，颗粒大小可人工控制，
标记试剂易制备。
缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰 大(背景)
金标抗体双重抗原标记常用间接法显 示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。 优点：敏感性提高，操作步骤减少
缺点：标记二抗质量要求高，背景染色深。
可通过采用固相吸附或过量二抗封闭， 或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗 原结合部位（Fab段）灭活加以克服。
优点：方法敏感、特异 缺点： 需选用各自特定的激发滤光片分别观察或 二次曝光显影 样本不能长期保存 组织结构背景不清晰。
直接法---特异、快速
技术类型
间接法---敏感、多用
异种动物抗体---常混合应用，操 作步骤少，脱片率相对较低
抗体试剂
同种动物抗体---分别应用，操作步骤加
倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标记 交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲 醛蒸气处理
汞5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗后，
以2.5%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；
(2)0.3% H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来 水洗，蒸馏水洗,入PBS(0.01mol/L pH7.2);
免疫组化-双重染色
免疫组化-双重染色免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
免疫组织化学染色技术
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体）
孵育切片 发色剂显色 （核复染）
（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
HRP + H2O2
HRP ·H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
（3）浸蜡
组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程 称浸蜡。 为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡 浸渍。 用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温 蜡，在60 ºC以下浸透。
（4）包埋
浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡 到入包埋盒，冷却后取出，修块。
4. 石蜡切片的制作
（1）载玻片涂片的制作
• 免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某 种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种 显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部 位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗 原是否存在。
¶ 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。
¶ 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。
甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。
¶ 不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的
抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。
免疫组织化学染色技术
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荧光素-抗体标记
❖ FITC-IgG（蛋白）
技术类型
❖ 直接染色法 ▪ 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)
❖ 间接染色法 ▪ 荧光素标记第二抗体（Ab2) ▪ 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）
直接法
❖ 优点 ▪ 简单 ▪ 特异
实例：细胞鉴定
❖ 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） ▪ T细胞 • CD3+
荧光素
❖ 异硫氰酸荧光素（FITC）
黄绿色荧光
520-530 nm
490-495 nm
荧光素
❖ 四乙基罗丹明（RB200）
橘红色荧光
625 nm
540 nm
荧光素
❖藻红蛋白（PE）
488-561 nm
578 nm
荧光素
❖别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC ）
660 nm
650 nm
免疫组织化学染色技术
李会强 医学检验学院
Email:lihuiqiang1965@
组织化学染色技术
❖ Histochemistry Technique
❖ 观察对象
▪ 组织、细胞
❖ 使用工具
形
态
▪ 普通显微镜
与 结
▪ 荧光显微镜
构
苏木素 曙红
免疫组织化学染色技术
❖ Immunohistochemistry Technique ▪ 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位 通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反 应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。
标本类型
❖ 组织标本 ▪ 冰冻切片 ▪ 石蜡切片（脱蜡和水化）
双重免疫荧光细胞化学标记方法
双重免疫荧光细胞化学标记方法双重免疫荧光细胞化学标记方法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色。
一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A或抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TM—RITC或RB200标记或PE标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。
在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗丹明标记，可采用以下染色方法：1．一步法双重染色方法先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。
2．二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A 抗体染色，按间接法进行。
结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。
激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
主要用途：1．细胞及生物荧光样品观察分析。
2．绿荧光蛋白分析。
3．荧光原位杂交分析。
4．光切片扫描。
5．3D图像处理。
6. 时间序列拍摄成像.。
双重或多重免疫组化标记(共42张PPT)
4)洗，10min×3，(第一重ACTH-TRITC标记染色已完成)。 （二）双重或多重免疫酶标记染色 (15)荧光显微镜下分别以546nm及490nm波长的激发光观察切片组织内TRITC及FITC所标示的ACTH及GH抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC
(16)用彩色底片对切片同一部位用546nm及 490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在 同一张照片上显示不同颜色标示的ACTH与 GH两种抗原。
TRITC-GAM IgG
游离Fab
T
鼠抗人ACTH （IgG）
ACTH抗原
TITC-GAM IgG
GH抗原
F
Fab被灭活
T
T
鼠抗人GH （IgG）
图1 同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理
T F
（二）双重或多重免疫酶标记染色
以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示 同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所 建立起来的多重免疫标记染色方法。特点是光 镜下可以同时观察和对比，样品保存时间相对 较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光 染色法更为常用。
(7)蒸馏水浸洗后，空气中干燥；
(8)置盛有多聚甲醛粉末的密闭容器内， 80℃温箱中以多聚甲醛蒸气处理1h，冷却取 出，入蒸馏水，换洗2次。
(9)再按(4)----(8)步骤作第二重抗原染色， 这次一抗用鼠抗GH单克隆抗体(1:400)；二抗 用15nm胶体金标记的羊抗鼠IgG，在二抗孵 育并清洗后，入2％的戊二醛及3％多聚甲醛 的TBS (pH7.4)溶液中固定30min，经蒸馏水 换洗3次，再以1％醋酸铀和构橼酸铅作常规 电子密度的染色。
(3)加入1％HSA 5min；不洗；
免疫组化（IHC）经验超全总结
免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。
我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。
经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。
一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
1.单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
免疫组化-双重染色
免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
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3. 步骤: a: 第一次染色后, 除去抗体和 酶而使有色反应终产物留在 抗原部位, 再用同样方法进行 第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及 NGS封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗. *. 氧化法洗脱. TBS洗. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS 洗. 甘油胶封片.
大鼠垂体前叶促性腺激素细胞 (蓝色)和生长激素细胞(棕色), 免疫酶(PAP法)双重染色. 1993.
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b: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的部位. 用有 机溶剂将反应终产物溶解除去, 洗脱抗体复合物, 然后进行第 二次染色. 对同一部位再一次照相, 比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗. *. TBS封片, 照相(注意防止切片干燥). *. 去盖片, TBS洗, 再用酒精-二甲苯-酒精处理, 除去CN蓝色反 应产物, DDH2O洗. *. 氧化法洗脱, TBS洗. *. PAP法第2次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS洗. *. 甘油胶封片, 找出第一次照相的部位, 再次照相.
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假性双标的来源
第一次用ABC法染色, 氧化法洗脱抗体. 对照 试验证实此为假性双标. 1992.
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2. 抗体洗脱法: a. 酸洗法: 在pH2.2甘氨酸(Glycine)-HCl缓冲液中加入适量二 甲基甲酰胺(Dimethylfomamide, DMF), 作用1~4小时使抗原-抗 体复合物解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10~260, 1分, 氧 化除去抗体, 0.5%偏重亚硫酸钠 (Sodium Metabisulfite, Na2S2O5)漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对第二种 抗原的影响(可设立对照). c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80℃烤箱1~4小 时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.
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Texas red- 2nd anti-insulin, FITC-2nd anti glucagons in mouse pancreas.
Alexa Fluor 568-2nd anti-giantin in G, Alexa Fluor 488-2nd anti-NPCP, Alexa Fluor 350-phalloidin. Tahr Ovary Epithelial Cells (HJ1.Ov Line).1st antibodies shows EEA1, Alexa Fluor 568-1st antibodies shows beta-tubulins. Cultured 18embryonic day rat hippocampal neurons..
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B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自 不同种属的动物如兔和豚鼠 (Guinea pig). 2. 两种来源于同种动物或不 同种动物的二抗(如羊抗兔 IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗 兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以 FITC和TRITC标记. 3. 染色步骤: a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第 一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育 切片, 显示第二种抗原. 或者将两种一抗混合后孵育切片, 再 将两种标记的二抗混合后孵育切片. b. 其余同前.
第八章. 免疫组化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry) 用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两 种以上的抗原, 以发现其定位, 形态和功能上的相互关系. I. 连续切片双重染色法 A. 最简单最可靠. 用同样的免疫组化方法, 在两张相邻切 片上各自显示一种抗原, 然后比较. 不会互相干扰或出现 假双标. B. 切片厚度1~3m, 否则不能确保双阳性结果. 神经组织 切片10~20m, 可采用“镜像”法 即相邻切片翻转后贴在 载玻片上, 软件PS处理. II. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的 抗体, 显示不同的颜色.
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Texas Red-2nd anti-histone, Alexa Fluor 488-2nd anti-PMP70 in peroxisome, Alexa Fluor 350phalloidin. Indian Muntjac deer skin fibroblast cell.
FITC-2nd anti-microtubules, TRITC-2nd anti-actins, DAPI shows nucleus in cultured Bovine pulmonary artery endothelial cells.
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COS7 cells, Y.W Lin. Nuclei were stained by Hoechst blue, USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594. Mixed color is yellow.
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A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490~5→520~30nm, 绿色荧光)和TRITC (550→620nm, 红色荧光)或其他荧光染料分别标记的两种一 抗混合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片. 3. 观察: 同一个视野里. a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行 观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗 原的细胞(呈绿色或红色). 如果两种抗原存在于同一个细胞 或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色.
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III. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 常见于两种一抗来自同种属动物. 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的电 子供体如DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两重染色之间需将第 一次染色反应中的各级 抗体和酶(步骤a)及其反 应产物从组织上洗脱 (步骤b). c. 连续做两次染色, 所 费时间较长.