中性缓冲福尔马林配制方法
HER2基因扩增检测试剂盒说明书
HER2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）说明书【产品名称】通用名称：HER2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）英文名称：Zyto Light SPEC HER2/CEN17 Dual Color Probe Kit【包装规格】货号Z-2020-5：5测试/盒货号Z-2020-20：20测试/盒【预期用途】本试剂盒用于检测经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌组织切片中HER2基因的扩增状态。
本试剂盒尤其适用于免疫组织化学HER2（ERBB2）蛋白检测结果为不确定的标本的检测。
HER2基因扩增是确定靶向治疗适应症的重要指标，基于本试剂盒未与具体药物联合进行临床评价，临床医生应在本检测结果基础上结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他检测结果对患者的个体化治疗进行综合判断。
【检验原理】荧光原位杂交技术（Fluorescent In Situ Hybridization, FISH）是一种以荧光标记的核酸探针与组织中的特异核酸分子进行杂交的技术，其基本原理是利用荧光标记的核酸探针在变性后根据碱基互补配对原则准确识别待检样本中的靶核酸序列，经退火复性后形成靶DNA与核酸探针杂交体，通过荧光检测系统（荧光显微镜）直接观察和分析染色体或基因的数量或结构的状态。
本试剂盒内HER2/CEN17双色探针液（以下简称为探针）设计序列来源图见图1和图2。
将样本经福尔马林固定、石蜡包埋后制成4±1μm厚度的切片，固定于粘性玻片上。
切片经预处理后，将HER2/CEN 17双色探针液与待测样本DNA变性、杂交。
杂交完成后，通过一系列洗涤缓冲液洗去未结合探针，并用DAPI（4，6-二咪基-2-联苯基吲哚）对样本中的细胞核复染成蓝色。
DAPI是一种蓝色荧光素，为DNA特异性染色剂。
探针杂交信号可通过配置相应滤光片的荧光显微镜进行观察。
在显微镜下观察细胞核内的荧光信号，对HER2基因（绿色荧光染料ZyGreen：激发波503nm，发射波528nm，同FITC）和CEN17着丝粒（橙红色荧光染料ZyOrange：激发波546nm，发射波572nm，同罗丹明）信号进行计数，计算比值（HER2/CEN17），从而判断HER2基因状态。
福尔马林说明书
福尔马林组织固定剂说明书【产品名称】福尔马林组织固定剂【产品明细】由10%中性福尔马林溶液（即4% 甲醛）、磷酸盐缓冲液等组成。
【包装规格】5ml;10ml;12ml ；15ml; 20ml; 25ml； 30ml; 40ml; 50ml ；60ml；100ml; 200ml；500ml; 1000ml; 2000ml ；2500ml; 3000ml；5000ml; 10000ml；25000ml; 30000ml 【预期用途】保持细胞、组织的固有形态和结构。
【固定原理】固定任何蛋白质，防止组织和细胞的自溶。
【适用范围】适用于人体、动物组织标本的固定。
【操作步骤】1. 将福尔马林组织固定剂编号、写上姓名等；2. 将离体组织及时浸入福尔马林组织固定剂中，一般不超过5分钟，组织标本的体积与液体的比例为1：4，固定时间为2至12小时。
【注意事项】1、小块组织标本（小于1.2CM*1.2CM*0.6CM）及各种活检组织标本，固定2至12小时即可，直接进行脱水、浸蜡、切片、染色等。
2、大块的组织标本需固定在12小时以上；或将大块的组织标本固定2小时后，取材，再固定2小时即可。
【贮存条件】常温保存【贮存环境】常温、阴凉，相对湿度不大于82%【医疗器械注册证书编号】保质期：两年生产批号：20131022【生产企业登记号】2010002【产品注册证书号】粤中食药监械（准）字2013第1400100号【产品标准号】YZB/粤中0023-2010【生产企业】中山市康乃欣生物医疗科技有限公司注册地址：中山市东区长江北路328号骏贤居E幢106室邮编：528403 网址：厂址：中山市东区沙岗管理区顺兴东路7号第1幢3楼之二电话：*************传真：*************。
固定液
1．经过固定的组织可保持在10%福尔马林或70%乙醇中。
2．染色前脱掉组织中的苦味酸①自来水冲洗②50%乙醇③或70%乙醇饱和碳酸锂
乙醇BOUIN’S液（DUBOSCQ-BRAZIL FLUID）
用途：用于固定肾活检，组织学制备固定液。
试剂：
乙醇Bouin’s贮存液:
80%乙醇750.0ml
甲醛300.0ml
步骤：
1．活检标本要立即放入Hollande’s固定剂中，标本容器上注明时间。
2．标本完成固定后保持在70%乙醇中。
3．不能让Hollande’s液固定的标本与磷酸缓冲福尔马林接触，否则会出现蓝色沉淀。
ORTH’S液
用途：用于证实肾上腺胞浆中嗜络微粒，这种证明可能对嗜络细胞瘤的诊断很重要。不是一种好的多用途的固定剂。
苦味酸5.0g
充分混合，液体稳定性2年，标明配制日期。
工作液：
贮存液70.0ml14.0ml
醋酸5.0ml10.0ml
使用前加醋酸。
固定时间：1～4小时。
步骤：
1．把新鲜组织标本放进乙醇Bouin’s工作液中。
2．充分固定后把组织移到70%的乙醇中。
HOLLANDE’S固定液
用途：作为胃肠和前列腺活检基本固定剂，这种固定剂让H.E染色更清晰，它“软化”组织避免切片脆裂。苦味酸会溶解掉红细胞。
ZENKER’S液
用途：Zenker’s液是一种核固定剂。该液是细胞学及病理学常用的固定剂，对细胞核固定最好，最适合于造血和网状内皮组织的固定。也常作为三色染色的组织固定剂，在三色染色中还作为媒染剂使用。但对于含血量较多的组织标本尽量不要选Zenker’s液固定。
试剂：
Zenker’s贮备液：
10中性福尔马林
产品名称：10%中性福尔马林组织固定液简介：10%中性福尔马林组织固定剂，是由10%中性福尔马林溶液（即4%甲醛）、磷酸盐缓冲液等组成。
用作固定的浓度为10%的福尔马林，实际含甲醛4%，10%福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
配制方法：在病理科、手术室中运用，10%福尔马林固定液具备两个条件。
条件一：福尔马林在溶液中的含量浓度为10%（即甲醛含量为4%），甲醛在水中最高浓度为40%，即10%的中性福尔马林溶液，其中甲醛含量即是10%的40%甲醛。
10%中性福尔马林固定剂条件二：10%中性福尔马林溶液的酸碱度为PH值7.2~7.4之间。
调配标准符合国家标准，具有完善的标准体系。
配制过程中特别注意事项：原料很重要，水、甲醛、磷酸二氢钠，磷酸氢二钠。
一般厂家很不注重水，自来水，蒸馏水、去离子水都不太标准。
康乃欣公司用的水是这样一个流程：自来水经过四次中性树脂过滤，目的是去除水中杂质和离子，接着经过紫外线灭菌，经过微纳米中性树脂过滤去菌体尸体，最后经过双重蒸馏后得到的水，才用于调配10%中性福尔马林固定剂。
康乃欣用的40%浓度甲醛，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠都是分析醇。
在配制10%中性福尔马林固定液使用车间，都是三十万级车间、机械流水线灌装。
康乃欣质量标准高于国家标准，采用国际通用标准。
产品用途：维持保存、固定细胞和组织固原有的形态和结构。
适用范围：用于人体、动物组织标本的固定。
产品成分：10%中性福尔马林溶液（即4%甲醛）、磷酸盐缓冲液等。
产品特点：渗透力强、固定均匀；对组织收缩少，尤其对神经及髓鞘、脂肪、糖等固定效果最佳。
操作步骤：1、先在组织固定剂上编号及写上相关信息；2、将离体组织及时浸入固定剂中，离体时间一般不超多5分钟，固定时间为2—12小时。
产品说明：1、组织标本的体积与液体的比例为1:4，此值效果最佳；不大于1:3.2、小块组织标本﹙小于1.2cm×1.2cm×0.6cm）及各种活检验组织标本，固定2—12小时即可，可直接进行切片、脱水、染色、镜检等操作。
10％中性缓冲福尔马林配制中应注意的问题
10％中性缓冲福尔马林配制中应注意的问题陈余朋;王行富;王密;王鹏程【期刊名称】《湖北民族学院学报（医学版）》【年(卷),期】2012(029)002【总页数】2页(P67,69)【关键词】中性缓冲福尔马林;福尔马林;配制【作者】陈余朋;王行富;王密;王鹏程【作者单位】福建医科大学附属第一医院病理科福建福州350005;福建医科大学附属第一医院病理科福建福州350005;福建医科大学附属第一医院病理科福建福州350005;福建医科大学附属第一医院病理科福建福州350005【正文语种】中文【中图分类】R36110%中性缓冲福尔马林溶液(pH值7.2～7.4)是临床诊断及实验病理学中最常用的固定剂，具有较强的组织穿透能力，组织收缩小，固定均匀、稳定，能使组织硬化，保证HE制片的高质量；能更好的保持组织的抗原性[1,2]，有利于免疫组织化学标记物的检测。
研究[3]表明用10%中性缓冲性福尔马林固定剂的石蜡组织提取的DNA在质量上明显优于普通的非缓冲型福尔马林固定剂。
ASCO /CAP HER-2检测指南和我国2009年HER2基因检测指南指出，组织处理的标准化固定剂为10%中性缓冲福尔马林, 以获得最佳的原位免疫荧光检测[4,5]。
目前很多医院尤其基层单位在10%中性缓冲福尔马林配制上并不规范，主要有以下问题应引起同行重视。
试剂称重的准确性按照临床病理技术操作规范[1]，10%中性福尔马林固定液的配制方法(1000 ml)：甲醛(40%)100 ml，无水磷酸氢二钠6.5 g，磷酸二氢钠4 g，蒸馏水900 ml。
该配制方法并不能直接准确地配制10%的中性缓冲福尔马林，因为其中磷酸二氢钠并没注明是无水还是含一水化合物(NaH2PO4·H2O)或二水化合物(NaH2PO4·2H2O)，使用不同磷酸二氢钠的量将直接影响最终的pH值。
按照《组织学技术的理论与实践》介绍的10%中性福尔马林的配制方法[2]:福尔马林(37%-40%的甲醛溶液) 100 ml，Na2HPO46·5 g，NaH2PO4·H2O 4 g，蒸馏水900 ml,pH值应为7.2-7.4, 该配方明确磷酸二氢钠是一水化合物，只要这样准确称量，准确配制，pH值即为7.2～7.4。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。
它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。
本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。
步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。
2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。
步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。
2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。
3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。
步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。
2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。
3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。
步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。
这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。
2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。
步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。
2.孵育时间通常为30分钟至1小时。
步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。
2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。
步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。
步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。
2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。
步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。
缓冲液及组织固定液的配制
缓冲液及组织固定液的配制1、磷酸盐缓冲液的配制关于缓冲溶液PB的配制，好多参考书如生物技术实验的后面均附有缓冲溶液的配制配方，可以根据需要配制pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲。
磷酸盐缓冲液称简PB，加NaCl（氯化钠）的称PBS，加KCl（氯化钾）、NaCl（氯化钠）的称KPBS。
S就是指氯化钠的含量，一般为0.85％，即是100ml里面加0.85克，这个时候的PBS的浓度是0.1M的。
一般在免疫组化洗涤中采用0.01M的PBS，pH7.0～7.4。
我们在实验中直接将0.1M的稀释十倍，即可。
最好能现配现用。
母液4℃可以保持1～2周，影响不大。
成份分子量（MW）浓度（g/1000mL）0.01M PBS①0.1M PBS0.1M PBNa2HPO4·12H2O 358.14 2.684 29.009 29.009NaH2PO4·2H2O 156.01 0.39 2.964 2.964NaCl 58.44 8.5 8.5~9 /pH值/ 7.4 7.4 7.4注：①配方来自网上。
2、组织固定液的配制2.1、4%多聚甲醛-0.1M磷酸缓冲液[1]（pH=7.3）：多聚甲醛40g，置于三角烧瓶中，加入500~800mL 0.1M的磷酸缓冲液（PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）至粉末完全溶解，通常需要滴加少许1N NaOH才能使溶液澄清，最后补足0.1M PB至1000mL，充分混匀。
该固定试剂适用于光镜免疫细胞化学研究，因较温和，适用于组织标本的较长期保存。
2.2、10%中性缓冲福尔马林固定液[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，蒸馏水900mL，NaH2PO4（磷酸二氢钠）4g，Na2HPO4（磷酸氢二钠）6.5g，混合摇匀后调pH至7.2~7.4。
2.3、10%福尔马林固定液配制[2]：甲醛溶液（37~40%）100mL，自来水900mL，混合后在溶液中加入碳酸钙使溶液呈中性或偏碱性。
Masson三色染色液染色步骤及注意事项
Masson三色染色液染色步骤及注意事项步骤一：预处理1. 切片：将需要染色的组织标本切成厚度约为5um的切片，将切片均匀地放置在已经预先烘干和标记好的玻片上。
2.固定：用10%中性缓冲福尔马林固定切片，固定时间约为24小时。
步骤二：染色1. 染色剂的准备：将Masson三色染色液购买回来后，根据品牌推荐比例稀释至适当浓度。
不同品牌染色液稀释比例可能有所不同，因此以具体品牌的说明为准。
2.染色操作：(1)将切片放入染色盒中，并将染色盒放入水浴中加热，温度为60-70摄氏度，时间为20-30分钟。
(2)将加热后的染色盒取出，用水冲洗2-3分钟，直至明显的污染物被冲走。
(3)将切片置于70%酒精中，时间为5分钟。
(4)在20%盐酸酒精中浸泡1-2秒钟，然后立即将切片漂洗至酸性的第一盐酸酒精。
(5)在酸性的第一盐酸酒精中浸泡30秒至1分钟，然后漂洗至酸性的第二盐酸酒精中。
(6)在酸性的第二盐酸酒精中浸泡30秒至1分钟，然后漂洗至蒸馏水中。
(7)转移到可溶性亮蓝GR中染色5分钟。
(8)快速漂洗后，放入蒸馏水中清洗1-2分钟。
(9)再次转移到1%醋酸中染色1分钟。
(10)最后，在6%石蜡溶液中浸泡5-10分钟。
步骤三：封片1.脱水：将切片放入95%乙醇中，时间为1-2分钟，然后放入绝对乙醇脱水2-3分钟。
2.渗透：将切片放入二氯甲烷中，时间为5分钟，再在房温下放置3-5分钟以充分渗透。
3. 封片：将切片放入500-1000ml锡兰红封片剂中，时间为1-2分钟，然后将切片转到盖玻片上，将封片剂挤满，盖上玻片，压平后放在60摄氏度的烘箱中加热2-3小时。
注意事项：1.操作中应注意个人防护，佩戴手套和口罩，避免接触有害物质。
2.染色过程中要严格控制温度和时间，避免染色过程中出现偏差。
3.在脱水和封片过程中要注意将切片完全浸透，防止切片变形或脱落。
4.染色溶液和液体处理过程中，应注意防止溅溢和污染，保持操作环境清洁。
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甲醛是一种气体，约有40%重量溶于水。
这是一种还原剂，颇易挥发，这种饱和溶液称为甲醛溶液；质量分数含35％～40％的甲醛水溶液叫“福尔马林溶液”。
•10%福尔马林的组成系；
•甲醛溶液10ml
•水90 ml
•它是一种使用广泛、简便的固定剂，同时又是一种良好别的标本保存液。
经它固定的标本，可适应一些特殊染色。
它的渗透性较强，固定均匀，能增加组织的韧性，组织缩轻微，硬性大于酒精。
•它具有杀菌和防腐能力，是一种良好的杀菌剂。
常作为浸渍标本的溶液。
甲醛为较高毒性的物质，
•中性福尔马林固定液（含磷酸盐缓冲液）适用于临床生物组织标本的固定。
结果用光学显微镜观察即可。
•10%中性缓冲福尔马林配制方法：
甲醛100ml
磷酸二氢钠4g
磷酸氢二钠 6.5g
蒸馏水900ml
•中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为首选固定液。