中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验

第34卷 第5期水生生物学报Vol. 34, No.5 2010年9月ACTA HYDROBIOLOGICASINICASep, 2 0 1 0收稿日期: 2010-03-18; 修订日期: 2010-06-29基金项目: 浙江省重点科技项目(No. G2*******)资助作者简介: 沈文英(1970—), 女, 浙江绍兴人; 副教授, 硕士; 主要从事水生经济动物营养和病害防治研究。

E-mail: zoology@ 通讯作者: 李卫芬, E-mail: wfli@DOI: 10.3724/SP.J.1035.2010.01060中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验沈文英1,2 李卫芬2 高 研2(1. 绍兴文理学院生命科学学院, 绍兴 312000; 2. 浙江大学动物科学学院饲料研究所, 杭州 310029)ISOLATION AND DRUG SENSITIVITY STUDY OF PATHOGENIC BACTERIA AEROMONAS VERONII FROM SOFT-SHELLED TURTLE,TRIONYX SINENSISSHEN Wen-Ying 1,2, LI Wei-Fen 2 and GAO Yan 2(1. College of Life Science , Shaoxing University , Shaoxing 312000, China ;2. Institute of Feed Science , College of Animal Science , Zhejiang University , Hangzhou 310029, China )关键词: 中华鳖; 维隆气单胞菌; 分离鉴定; 药敏试验Key words: Trionyx sinensis ; Aeromonas veronii ; Isolation; Drug sensitivity中图分类号: S947.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2010)05-1060-05中华鳖(Trionyx sinensis )是我国主要淡水养殖名优品种之一。

但随着中华鳖养殖规模的扩大和集约化程度的提高, 导致鳖病暴发流行, 阻碍了养鳖业的进一步发展。

迄今为止, 研究发现的鳖病共约40余种, 其中以中华鳖疖疮穿孔病、腐皮病、白底板病、肠道坏死症及细菌性肝水肿病为主要病害[1,2], 主要由嗜水气单胞菌和温和气单胞菌感染引起[3—5]。

维隆气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属的一个成员, 具有较强的毒力[6,7], 能引起腹泻、肺炎以及伤口感染[8]和自身限制的肠胃炎[9]。

有关维隆气单胞菌在水生生物上的致病性尚未见报道。

浙江省是开展中华鳖工厂化养殖较早的地区, 目前约占全国产量的60%以上。

2006年6月起, 浙江省暴发了大面积的鳖病, 给养殖户造成了严重的经济损失。

本研究对发病中华鳖典型病灶、肝脏和肺组织进行了病原菌的分离、鉴定及药敏试验, 为有效防治鳖病提供技术指导。

1 材料与方法1.1 材 料实验用患病鳖于2006年6月取自浙江省临平市中华鳖养殖场, 共3只。

临床症状表现为: 精神沉郁、行动迟缓、反应迟钝; 底板呈白色; 四肢、颈部和裙边等处均有溃烂, 斑中间有灰褐色圆形凹陷; 背壳有大量腐皮脱落, 壳上有硬币大小的白色凹斑。

剖检病变表现为: 腮腺红肿、组织糜烂、有出血斑; 打开内腔有异味、肝肿大、质地脆化、表面有小出血点; 胃、肠壁出血、内充满黏性 液体。

健康鳖取自浙江省临平市中华鳖养殖场, 规格为100—200 g, 在水产基地养殖一周后, 确认健康后用于致病性实验。

鉴别培养基和微量生化管购自杭州天和微生物试剂厂, 质粒提取试剂盒、割胶回收试剂盒、T 4连接酶、T-Vector 购自上海生工生物工程有限公司, 克隆宿主菌 E. coli Top10, 本实验室保存。

1.2 病原菌的分离与培养从患病鳖典型病灶、肝脏和肺组织取样接种到LB 和TCBS 培养基上, 30℃培养18h 。

结果: LB 平皿上长出圆形, 边缘整齐的白色半透明状菌落; TCBS 上呈黄色菌落。

挑选单个菌落作纯培养, 分离菌经30 1℃8h 培养后作毒力试验和细菌鉴定。

1.3 人工感染与动物毒力检测试验按刘恭植等[10]反复法进行。

将纯培养菌株于营养琼脂培养基(NA)斜面上活化后(30, 18h), ℃用无菌生理盐5期沈文英等: 中华鳖病原性维隆气单胞菌的分离及药敏试验 1061水洗下菌苔, 采用比浊法制成 1.0×108 CFU/mL的菌悬液, 取该培养物对已暂养一周的100—200 g左右健康鳖进行腹腔注射, 对照组注射无菌生理盐水, 剂量均为0.4 mL/只, 试验组和对照组各注射5只, 分别饲养于28—30℃的水族箱中, 观察 10d。

同上法重复感染。

1.4病原菌形态分析和生理生化特性鉴定将纯培养菌株于营养琼脂培养基(NA) 30℃培养18h,用等渗的无菌生理盐水洗下菌苔, JEM-1011型透射电镜(日本电子)观察病原菌形态。

细菌生理生化特性鉴定按照微量生化管操作说明进行。

1.5细菌基因序列的扩增和测序以细菌16SrDNA通用引物[11](8f: 5′-AGAGTTTGAT- CCTGGCTCAG-3′, 1492r: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC- GCA-3′)为引物, 全菌裂解法制备的菌液DNA为模板, 采用常规的PCR方法进行扩增。

PCR反应体系(50 μL)为: 5 μL的10×扩增缓冲液,模板DNA 1 μL,引物10 μmol/mL各1 μL, 10 μmol/mL dNTP 1 μL, 5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL, 超纯水40.5 μL, 混匀。

反应条件: 94 ℃预变性5 min; 94 44s℃, 52 60s℃, 72 2 min℃, 30个循环; 最后72℃延伸5 min。

取PCR产物10 μL, 1%琼脂糖凝胶电泳检测。

用AxyprepDNA凝胶回收试剂盒方法回收和纯化PCR扩增片段。

将回收产物克隆到PUCm-T载体, CaCl2转化法将连接好的重组质粒转化到E. coli Top10感受态细胞, 通过蓝白斑筛选重组子, 采用PUCm-T载体引物M13 F和M13 R鉴定出阳性重组子, 进行序列测定(Invitrogen 公司)。

1.6药敏性测定采用药敏纸片琼脂平板扩散法进行。

将病原菌纯培养物于肉汤液中(28)℃培养16h后, 取0.2 mL均匀涂布于平皿上, 贴上药敏纸片, 设4个重复, 于28—30℃下培养18—24h后测量抑菌圈直径。

2结果2.1中华鳖毒力感染实验人工回感中华鳖结果表明, 分离菌株对健康鳖有较强的致病力, 3d发病率高达100%, 发病中华鳖临床症状和病理变化与自然病例相同, 从病灶和内脏组织均能分离到接种菌, 感染后10d内死亡率达到100%。

对照组鳖则无异常, 仍健康活泼。

2.2病原菌的鉴定细菌的形态鉴定分离菌株培养18 h后形成的菌落低凸、圆形, 直径l—2 mm, 边缘光滑湿润, 有刺激性气味。

光镜检测发现分离菌株革兰氏染色为阴性, 短链状杆菌, 呈单个或成对分布; 电镜观察发现该菌具有一条明显的鞭毛, 鞭毛长约为菌体长的2倍(图1)。

细菌的生理生化特性分离菌最佳生长条件是30 18h,℃也能在37 LB℃上生长, 在LB培养基中浑浊均匀, 在半固体培养基中有动力, 此结果与形态观察结果相吻合。

该菌氧化酶和v-p反应阳性, 能产生吲哚, 利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖等作为碳源和能量来源, 并能产酸, 具有区别于其他气单胞菌的特征: 赖氨酸脱羧酶阳性, 精氨酸双水解酶阴性。

该菌大多数生理生化特性与维隆气单胞菌(Aeromonas veronii)标准菌株一致(表1)。

根据《常见细菌系统鉴定手册》[12]和布坎南等编的《伯杰细菌鉴定手册》[13]鉴定为维隆气单胞菌(A.veronii)。

细菌16S rDNA基因序列测定分离菌株基因组经PCR扩增获得了预期的1.5 kb的特异条带, 挑选阳性克隆进行测序, 获得了细菌16S rDNA基因的部分序列。

测定的序列(登录号为HM032146)进行BLAST同源序列比对, 与维隆气单胞菌(A. veronii)参考菌株(X74684.1 ATCC 35624T)的16S rDNA 同源性达99%, 分离菌株16S rDNA基因和维隆气单胞菌参考菌株16S rDNA基因图1 病原菌形态结构 (×8000)Fig. 1 The morphological structure of the pathogenic bacteria strain (×8000)1062 水生生物学报34卷表1病原菌的某些生理生化特征Tab. 1 Some physiologic and biochemical characteristics of the pathogenic bacteria strains生理生化特征Characteristics病原菌Pathogenic bacterium维隆气单胞菌A. veronii革兰氏染色 Gram stain G−G−运动性 Mobility + + 葡萄糖氧化发酵 Glucose oxidation/fermentation F F 鸟氨酸脱羧酶Ornithine decarboxylase −−氧化酶 Oxidase + + V-P反应 V-P reaction + + 苯丙氨酸脱氨酶 Phenylalanine deaminase −(+)赖氨酸脱羧酶Lysine decarboxylase + + 精氨酸双水解酶 Arginine dihydrolase −−葡萄糖 Glucose (+) + 麦芽糖 Maltose + + 鼠李糖 Rhamnose −−木糖 Xylose −−乳糖 Lactose + −山梨醇Sorbitol −−阿拉伯糖 Arabinose −−纤维二糖 Cellobiose −(+)甘露醇 Mannitol −+6% NaCl −−水杨苷 Salicin + + 七叶灵水解 Esculine hydrolysis −+吲哚 Indole + + 硫化氢H2S + −柠檬酸 Citric acid + + 丙二酸盐 Malonate −−注: +: 阳性; −: 阴性; (+): 多数阳性; F: 发酵Note: +: positive; −: negative; (+): majority positive; F: ferment表2抗生素敏感性测定结果Tab. 2 Results of drug sensitivity tests of the pathogens药物Antibiotics抑菌圈直径Diameter of inhibitory zone药物Antibiotics抑菌圈直径Diameter of inhibitory zone氯霉素 Chloramphenicol +++ 链霉素 Streptomycin ++四环素 Tetracycline +++ 万古霉素 Vancomycin ++氟哌酸 Norfloxacin +++ 利福平 Rifampicin ++庆大霉素 Gentamicin +++ 红霉素 Erythromycin +呋喃 Furan +++ 青霉素 Penicillin +注: +++: 抑菌圈直径> 15 mm; ++: 抑菌圈直径l0—15 mm; +: 抑菌圈直径< l0 mmNote: +++: diameter of inhibitory zone > 15 mm; ++: 10 mm < diameter of inhibitory zone < 15 mm; diameter of inhibitory zone < 10 mm的不同核苷酸位置分别位于 23(A→T)、24(C→T)、799(A→T)、891(- →G)、910(- →A)、924(- →G)。