基因工程_第八章_基因的表达

Transcript folded to form termination hairpin
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
E. coli
---------TTGACA--------TATAAT-----35 box -10 Pribnow box GENE
Animals
-----Various signal-------TATAAAT----25 box GENE
Commonly used promoters
The lac promoter:
The tac/trc promoter:
- A hybrid between the trp and lac promoters - Stronger than either and still induced by IPTG
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 P O 高效转录 P 乳糖 异丙基--D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
SD序列： mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD 序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处， 有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别， 帮助从起始AUG处开始翻译。 启动子：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始 复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程 的调节蛋白的结合位点。 终止子：常指转录终止子。①转录过程产生RNA的一段可 终止转录的茎-环结构序列；②位于模板基因下游该结 构所对应的DNA序列。在大肠杆菌中有依赖于ρ或不依 赖于ρ的两类终止子。 核糖体结合位点：核糖体识别并结合信使核糖核酸 (mRNA)的位点。原核生物信使核糖核酸起始密码子的 上游含有核糖体识别和结合序列；真核生物信使核糖 核酸的5′帽子结构对核糖体的识别起一定作用。
第八章 基因的表达
第一节 基因表达研究的方法 第一节 影响外源基因表达的因素
第一节 基因表达研究的方法
大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性
大肠杆菌是迄今为止研究得最详尽的原核生物； 结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因 表达调控机制有了清楚的了解； 已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各 种宿主菌和载体； 培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行 工业化批量生产； 实验已经证明，许多克隆的真核基因，如生长激素基 因和胰岛素基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达。
1. The Promoter
The promoter is the critical component of gene expression DNA sequence recognized by the RNA polymerase The bound polymerase initiates transcription downstream the DNA toward the gene There are strong and weak promoters
Plac
启动子
启动子的可控性
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达 Ptrp Otrp Ptrp Otrp 高效转录 阻遏蛋白 色氨酸 基底水平转录
Base pairing between a mRNA’s Shine Delgarno sequence and the 16s rRNA permit the ribosome to select the proper initiation codon The distance between SD sequence and the initiation codon of the gene is important to translation.
Ptrp 除去色氨酸
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
启动子
启动子的可控性
阻遏作用
噬菌体启动子PLL的可控性：
目的基因 噬菌体启动子PLL受CI阻遏蛋白阻 Ptrp 遏，很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的cI突 变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PLL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因 此常使用一个双质粒控制系统， 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PLL B 表达 A cI857 PLL B
2. Terminator
Stops RNA synthesis at specific points along the DNA template The enzyme stops polymerizing nucleotides into RNA, releases the RNA chain and leaves the DNA to eventually reinitiate at another promoter A terminator is usually a nucleotide sequence that can base pair itself to form a stem loop structure. The transcription will stop at this point.
The three most important signals for gene expression in E.coli
Ribosome Promoter binding site
Terminator
Gene
DNA RNA transcript
Point at which ribosome binds to mRNA
Upstream sequence around position -35 also have a region of sequence similarity, TCTTGACAT which is most evident in efficient promoters
Typical promoter sequences for E.coli and animal genes
ori Aprr pCP1 Tcrr
筛选Aprr、Tcss的转化子
3. Ribosome binding site (RBS)
RBS can vary in E.coli
A consensus sequence (Shine-Delgarno sequence) is centered ~10 nucleotides upstream from the start codon Most sites contain the minimal sequence UAAGGAGG
The promoter : marks the point at which transcription of the gene should start The terminator : marks the point at the end of the gene where transcription should stop The ribosome binding site (RBS): a short nucleotide sequence recognized by the ribosome as the point at which it should attach to the RNA molecule
启动子与RNA聚合酶 聚合酶 启动子与
RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。将各 种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase I水解 DNA，最后得到与RAN聚合酶结合而未被水解的DNA片 段，这些片段有一个由5个核苷酸(TATAA)组成的共同 序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框 (Pribnowbox)，这个框的中央位于起点上游10bp处， 所以又称—10序列(—10 sequence)，后来在—35 bp 处又找到另一个共同序列(TTGACA)。 Hogness等在真核基因中又发现了类似Pribnow框的共 同序列，即位于—25～—30 bp处的TATAAAAG，也称 TATA框(TATAbox)。
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5 Plac UV5 O Plac O 高效转录 葡萄糖代谢 CAP O cAMP浓度降低 基底水平转录 cAMP 高效转录
Main Features of E.coli Promoter