第八章酵母基因工程详解
第八章基因工程诞生与发展
有关基因工程技术发明获得 Nobel奖
第八章基因工程诞生与发展
基因工程概念
在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的 DNA片段，在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将 重组DNA与载体的遗传物质重新组合，
第八章基因工程பைடு நூலகம்生与发展
我是一个实验主义者，我能告诉你的检验 它是否有效的唯一方法就是尝试它。
——保罗·伯格
第八章基因工程诞生与发展
保罗·伯格 Paul Berg
• 保罗·伯格1926年生于美国。 在参加了第二次世界大战 后回到宾夕法尼亚州立大 学学习，1948年获生物化 学学士学位，
• 后在凯斯西部保留地大学 获生化博士学位，1959年 到斯坦福大学任教。
先进入市场。 美国已有40多种基因药物投放市场，主要用于治疗
癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌
感染、代谢病等疑难病症。
第八章基因工程诞生与发展
美国投放市场的基因药物，1997年超过60亿美 元，且每年以20%的速度增长。
我国也有10多种基因药物投放市场，但大部分基 因药物仍需进口。
因此，基因是企业家的聚宝盆。
因此，他开发了在酶的作用下在试管内将的噬菌体基 因与SV40基因结合在一起的技术。
第八章基因工程诞生与发展
DNA体外重组的创建成功， 是“遗传工程”的奠基之作。
EcoRI
＋
SV40 λDNA
1972. PNAS
David Jackson Robert Symons Paul Berg
《基因工程》第八章基因工程的安全防护
基因工程的安全防护
二. 生物公害的控制
1. 实验人员适应性训练 随着学科之间的交叉和渗透, 大量其它专业的科学家( 随着学科之间的交叉和渗透, 大量其它专业的科学家( 物 理、化学、工程学、数学等) 进入了这一领域. 这些人缺乏生 化学、工程学、数学等) 进入了这一领域. 物学, 特别是有关病原微生物的知识. 物学, 特别是有关病原微生物的知识. 对从事基因操作的实验人员进行以下几方面的训练: 对从事基因操作的实验人员进行以下几方面的训练: 不同危险度微生物的操作技术; 不同危险度微生物的操作技术; 关于物理防护的技术知识; 关于物理防护的技术知识; 关于生物防护的技术知识; 关于生物防护的技术知识; 有关拟开展的实验的安全知识; 有关拟开展的实验的安全知识; 处理事故的能力； 处理事故的能力；
基因工程的安全防护－生物公害的控制 2.生物防护 2.生物防护 ( Biological Containment ) 2) 宿主细胞 宿主细胞应当具有在特定的有选择的条件下生存、 宿主细胞应当具有在特定的有选择的条件下生存、繁 殖, 而在一般自然条件下很难生存和繁殖的生物特性( 例如, 而在一般自然条件下很难生存和繁殖的生物特性( 例如, 营养缺陷型菌株、低温条件生长菌株等) 营养缺陷型菌株、低温条件生长菌株等)。 DNA重组体 3) DNA重组体 DNA重组体在自然条件下对人类和生态环境应当是安全 DNA重组体在自然条件下对人类和生态环境应当是安全 无害的。 无害的。
基因工程的安全防护－生物公害的控制
4. 重组体的保管 除了上述的安全防护外, 除了上述的安全防护外, 还应该 : 建立特殊实验的管理和健康监督安全管理机构和规则; (1) 建立特殊实验的管理和健康监督安全管理机构和规则; (2) 对安全性没有把握的实验, 要进行特殊管理, 对安全性没有把握的实验, 要进行特殊管理, 并进行临 床人体实验; 床人体实验; 在实验前和实验后一年内, 应对实验人员进行健康检查. (3) 在实验前和实验后一年内, 应对实验人员进行健康检查.
《微生物学》主要知识点-08第八章微生物的遗传
第八章微生物的遗传概述：遗传(heredity or inheritanc® 和变异(variation)是生物体的最本质的属性之一。
遗传即生物的亲代将一整套遗传因子传递给子代的行为或功能。
变异指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。
基因型(ge no type某一生物个体所含有的全部基因的总和。
表型(phe no type)某一生物所具有的一切外表特征及内在特性的总和。
饰变( modification)不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、翻译水平上的表型变化。
8.1遗传变异的物质基础8.1.1三个经典实验1. 经典转化实验：1928年F.Griffith以Streptococcus pneumoniae为研究对象进行转化(transformation)实验。
1944年O.T.Avery等人进一步研究得出DNA是遗传因子。
S strun A2. 噬菌体感染实验：1952年Alfred D.Hershey和Martha Chase用32P标记病毒的DNA，用35S标记病毒的蛋白质外壳，证实了T2噬菌体的DNA是遗传物质。
3.植物病毒的重建实1956年H.Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）与TMV 近源的霍氏车前花叶病毒（Holmes ribgrass mosaic virus,HRV）所进行的拆分与重建实验证明，RNA也是遗传的物质基础。
8.2微生物的基因组结构：基因组（genome是指存在于细胞或病毒中的所有基因。
细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体（haploid）;真核微生物通常是有两套基因又称二倍体（diploid ）。
基因组通常是指全部一套基因。
由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
酵母基因工程
酵母基因工程一酵母基因工程的发展现状1.酿酒酵母自身的改造（1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母（4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达（5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母2酵母表达异源蛋白（1）表达水平（2）表达质量2酵母基因工程的发展趋势（1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷（2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向（3）利用酵母基因工程筛选更多新药（4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本（5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注3发展历程1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。
2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。
3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。
4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。
5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
二．酵母基因工程的优点1.安全无毒，不致病；2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；3.容易进行载体DNA的导入。
DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；4.培养条件简单，容易进行高密度发酵；5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能三．酵母表达系统（1）酵母表达载体①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。
原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。
酵母部分：1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；整合型载体的整合介导区。
2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列3基因启动子和终止子序列4信号肽序列②载体的复制形式附加型载体：在酵母染色体外自主复制1酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的整合型载体：随同酵母染色体一起复制1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体之间发生同源重组。
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养
基因工程菌培养方式
连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等 创造了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达水平或最大产率。
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是元件促进重组分子的缺失重排
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
r1质粒上的parb基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞基因工程菌的稳定性基因工程菌的稳定性提高基因工程菌稳定性的策略施加选择压力根据载体上的抗药性标记向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂成本较高提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时可以考虑将发酵过程分阶段控制在生长阶段使外源基因处于阻遏状态避免因表达造成不稳定性问题的发生
第八章基因工程电子教案
导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
目的基因的筛选和鉴定
(screening/selection)
• 遗传学方法
– 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 – 标志补救 表达产物与营养缺陷互补
• 3′→5′外切酶活性 • 5′→3′外切酶活性
3′→5′外 切 酶 活 性
5′
3′
3′
5′
5′→3′外 切 酶 活 性
末端脱氧核 苷酰转移酶 (TDT)
载体 vector
• DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和 表达
• 克隆载体、表达载体 • 原核载体: 质粒(pBR322,pUC…）
Eco RⅠ Hind Ⅲ
氨苄青霉素 抗性基因
(ampr)
Pst Ⅰ
pBR322
Bam HⅠ
Sal Ⅰ
四环素 抗性基因
(terr)
Ava Ⅰ
O ri
Pvu Ⅱ
常用的克隆载体
• λ噬菌体(λphage) • 基因组分三个区域: 左侧区、中间区（非必需
区）、右侧区 • DNA，替换型载体，外源DNA: 9~23kb • 常用: EMBL 系列、 λgt 系列、charon系列 • 粘性质粒(cosmid): λDNA的 cos区+质粒，双链
环状DNA，克隆容量: 40~50kb • M13噬菌体 • 最大优点: 产生单链DNA
特点:
cos:cohesiveend site
RF DNA: replicational form DNA
优点:
表达载体(expressing vector)
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生物效应
型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 型 外侧糖链添加缺陷型
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型
生物效应
1
改善重组蛋白分泌
2
提高重组蛋白表达
质粒
*只有大肠杆菌的复制子 *引入酵母基因组的同源序列 *载体以同源或非同源重组方式整
合入宿主基因组 *拷贝数：大多情况下为1个
以酵母标记基因（3)的5’端和3’ 端作同源序列
3 用于酵母转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 显性基因
营养缺陷型的互补基因
宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子 主要有：、、、
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
1、 2、 3、 4、 5、 6、 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由 4基因表达， 4-突变株能正常生 长。
1缺陷型： 1编码泛素激活酶E1，1突变是致死性的，但其等位基因缺陷是非 致死性的
4 - 5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如等）、和热休克处理诱
导细胞吸收外源。 特点：
吸收线型的能力明显大于环状，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌电击转化法
细胞：带壁完整细胞或原生质体 原理：通过电脉冲对细胞膜造成摄取通道 特点：转化率高（105 / ）、操作简便、适用范围广
载体：携带相应的合成基因 如：12、1、34 、3
选择压力：不完全培养基 如：、无机盐培养基
显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
标记基因
编码产物
遗传型
氨基糖苷转移酶
氯霉素乙酰转移酶
二氢叶酸还原酶
胺1
铜离子螯合物
2
蔗糖转化酶
糖2
乙酰乳糖合成酶
草剂
抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗 抗硫酰脲除
真菌基因工程
一、真菌表达系统的优缺点 二、酵母转化系统 三、甲醇酵母表达系统 四、丝状真菌表达系统
一、真菌表达系统的优缺点
具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点 具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距
1
提高重组蛋白表达
1
提高重组蛋白表达
11 改善重组蛋白分泌
提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
HOOC
76
E3
靶蛋白
E3
靶蛋白
蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
质粒
*复制子：染色体来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高达 5070%，主要是由于分配不均匀 所致。 :
质粒
*在中引入 ：着丝粒序列，来源于3号染色
体，有丝分裂稳定，低拷贝数 *复制子：染色体来源的 *拷贝数：1-5
质粒
*在中引入 ：端粒，染色体末端序列，利于
线性末端稳定 稳定性：随生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电激转化法
酵母菌原生质体转化法
细胞：去壁的原生质体 原理：以等渗缓冲液稳定原生质体，以2+诱导细胞
摄取外源。 特点：30%以上为多质粒共转化 转化效率：可达原生质体总数的1-2%，但操作周期长， 而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母（ ）： *无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真 核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理 毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（ ） 汉逊酵母：多型汉逊酵母（ ）
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（52） 对数生长期表达 稳定期关闭
3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（76） 对数生长期表达 稳定期关闭
4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
接合酵母属中的1和1，以及 克鲁维酵母属中的1等均与2μ质 粒类似。
1
A
2
同源重组 B
人工构建酵母质粒的共同特点
含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作 含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点 含有在酵母和大肠杆菌中进行选择的双标记 除YIp型质粒外均为穿梭载体
质粒
*复制子：2m质粒来源的 *拷贝数50-100 *不稳定 培养几代后，质粒的丢失率高 达5070%，主要是由于分配不 均匀所致。
其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统 乳酸克鲁维酵母（ ) 非洲酒裂殖酵母（ )
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白
能抑制超糖基化的突变类型
质的糖基化系统，但野生 突变类型
2、酵母载体系统
野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母） 人工构建质粒: 5种
酵母附加型质粒（） 酵母复制型质粒（） 酵母着丝粒质粒（) 酵母人工染色体（） 酵母整合型质粒（）
酿酒酵母中的2μ环状质粒
野生型，双链、环状、6
拷贝数达50至100个
反向重复序列，600 ，重组 编码产物驱动的同源重组 编码产物控制质粒的稳定性 的结合位点