第十五章 酵母基因工程
第十五章--酵母基因工程
2
15.1.2 发展现状
o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。
15.1.3 发展趋势
1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向 3．利用酵母基因工程筛选更多的新药 4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注
4
15.2 酵母表达系统
15.2.1 酵母表达载体
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。 o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。 o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列
5
② 整合型载体
o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。 o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。
外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元 o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。 o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。 o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。 o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。
酵母菌在基因工程中的应用
酵母菌在基因工程中的应用酵母菌是一类单细胞真核生物，是生物科学研究中的一种常见模式生物。
它们普遍存在于自然界中，可以在发酵食品的制备以及生命科学研究领域发挥着重要的作用。
在基因工程领域中，酵母菌更是被广泛应用，成为了基因工程领域的重要工具之一。
下面我们就来看看，酵母菌在基因工程领域中都有哪些应用吧。
一. 酵母菌作为表达宿主酵母菌是一类常见的蛋白表达宿主，能够快速高效地表达蛋白质，是一种常见的蛋白质产生工具。
一般来说，通过基因工程手段将需要表达的蛋白质的基因导入酵母菌中，利用其自身繁殖特性，迅速高效地表达出需要的蛋白质。
此外，在表达蛋白质的过程中，酵母菌的生长条件相对简单，可以通过温度、氧气、营养等因素的控制来实现高效的表达。
二. 酵母菌在药物研究中的应用当前，越来越多的药物研发都依赖于基因工程技术，而酵母菌则成为了药物研发中的重要工具之一。
通过将需要研发的靶点基因导入酵母菌中，可以模拟药物对生物体内靶点的作用过程。
此外，还可以通过酵母菌对药物副作用的研究，为药物的准确作用机制提供参考。
三. 酵母菌在癌症研究中的应用对于癌症的研究一直以来都是生物学家们所关注的重要问题之一。
而酵母菌则成为了癌症研究中的重要研究工具之一。
通过将癌症相关基因导入到酵母菌中，并通过对其复制、修复和细胞凋亡等过程的研究，可以更好地理解癌症的发生机制和治疗过程，为癌症的诊断和治疗提供更好的参考。
四. 酵母菌在基因组研究中的应用对于生命科学研究而言，基因组研究是一项重要的研究领域。
而目前，酵母菌的基因组研究也在不断地发展。
利用酵母菌基因组研究这一工具，可以揭示基因与生物型之间的关系，探寻基因突变造成遗传性疾病的可能机制，还可以帮助人们更好地理解基因间相互作用，促进基因工程技术的发展。
总之，随着基因工程技术的不断发展，酵母菌作为一种常见的模式生物，也在越来越多的领域中发挥着重要的作用。
通过其快速高效的蛋白表达能力以及对生物学过程的模拟研究，酵母菌为人们揭示了生物世界中的许多秘密。
原果胶酶酵母基因工程的构建
原果胶酶酵母基因工程的构建你知道果胶吗？那玩意儿是我们吃的水果里面的一个“小不点”，但它的作用可大了去了。
比如，苹果、橙子、葡萄这些水果，吃起来有时候口感有点儿“黏”，就是果胶在捣鬼。
它是一种天然的多糖，能帮助水果保持形状，还能让果酱、果冻变得有弹性。
你可能会问，果胶酶是啥？嗯，说白了，果胶酶就是帮助我们分解这些果胶的一个“小帮手”。
而且如果你把这个果胶酶放到酵母里，搞成基因工程，那效果就更了不得了。
嘿，这可不是开玩笑的，咱们今天就来聊聊如何构建这样一种“基因工程”。
说实话，基因工程这个词一出来，大多数人都会觉得高大上，跟自己没啥关系。
咱们可以把它想成一种“魔法”——只不过这个魔法是通过改造细胞里面的基因来实现的。
这就好像是你拿到了某个神奇的配方，能够让酵母在一定条件下“自己动手”产生果胶酶。
听起来是不是有点不可思议？但这一切都有它的道理。
咱得了解果胶酶是怎么工作的。
你知道果胶它可是水果里很重要的一部分，很多时候它给果实带来了“密密麻麻”的口感，或者让果实和果皮黏在一起。
所以果胶酶的任务就是把这些果胶分解开，让果实的组织更加松散，甚至能帮助果汁更容易流出。
比如做果汁的时候，加入果胶酶，能让你榨出来的汁水更加清澈、口感更好。
好了，明白果胶酶的重要性了吧？接下来就要看，怎么通过基因工程让酵母产生果胶酶。
酵母本身并没有这个功能，所以我们得给它“添点儿柴火”。
想象一下，你是一个“酵母雕塑家”，通过一根“神奇的针线”——就是基因技术，把果胶酶的基因从别的生物体里拿过来，然后放到酵母的基因组里。
这样，酵母就变成了一个“果胶酶工厂”。
是不是有点儿像给它加了个外挂，突然就能做一些它原本做不到的事儿？不过，这个过程可没那么简单。
你不能就随便把果胶酶的基因塞进酵母里面，给它一点“提示”就完了。
要确保它能好好发挥作用，还得考虑到酵母本身的特点。
你想想，酵母是一个微生物，它原本生活在一个特定的环境中，如果你给它加了“任务”，它能不能按时完成还得看你的安排。
第十五章：酵母菌基因工程选编
③易进行载体DNA的导入。DNA转化技 术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率；
④培养条件简单，容易进行高密度 发酵；
⑤能将外源基因表达产物分泌到培 养基中；
⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻 译后的修饰功能。
2.缺陷在于：
①表达效率相对低； ②酵母常有密码子偏爱性，真核基
因在其中表达时需要人工修正。
2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建
①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大 小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp 就有一个ARS元件。
②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而 由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。
③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数 最高可达200个，但是经过几代培养 后，质粒丢失率达50%-70%，主要由 于分配不均匀所致。
三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬 酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影 响蛋白质的生物活性。整个糖单位 由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿 酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修 饰和加工系统对来自高等动物和人的异 源蛋白活性表达是极为有利的，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很 难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基 化缺陷菌株非常重要。
②YAC载体的装载量建
①YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母 片段只提供选择性标志，没有复制起点。
②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA）， 但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。
一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
酵母基因工程技术的综述与进展展望
酵母基因工程技术的综述与进展展望引言:酵母是一类常见的真核生物，广泛存在于自然界中。
由于酵母具有独特的细胞结构和代谢特性，成为许多科学研究的理想模型生物。
基因工程技术的发展使得研究者们能够通过编辑和改造酵母的基因组，来实现多种生物学和应用学的目标。
本文将对酵母基因工程技术的现状进行综述，并展望未来的发展前景。
一、酵母基因工程技术的发展历程酵母基因工程技术的研究始于20世纪70年代。
最早的酵母基因工程是通过改变酵母细胞的遗传背景，来研究基因功能。
而后，随着重组DNA技术的引入，酵母基因工程迅速发展起来。
1981年，科学家们成功地将人类基因插入到酵母细胞中，这是一个重大突破。
随后的几十年间，酵母基因组测序的完成以及基因敲除和基因重组技术的发展进一步推动了酵母基因工程技术的成熟。
二、酵母基因工程技术的应用领域1. 功能基因组学研究：通过酵母基因组的全面敲除和突变，可以研究基因的功能和相互作用。
这有助于更好地理解酵母细胞的生物学过程，也有助于揭示生物学中的一些基本原理。
2. 药物筛选和开发：酵母作为模型生物，在药物筛选和开发领域具有重要地位。
通过构建酵母表达外源蛋白的系统，可以进行大规模的化合物筛选，以寻找新的药物靶点和治疗方法。
3. 工业应用：酵母在生物技术和食品工业中具有广泛的应用。
例如，酵母可以被用于生产酒精、酵母提取物和酵母蛋白等。
通过基因工程技术改造酵母菌株，可以增加产量和改良产品的品质。
三、酵母基因工程技术的挑战与限制尽管酵母基因工程技术在许多领域中取得了显著进展，但仍然面临一些挑战和限制。
1. 基因组稳定性：酵母细胞往往会发生基因组重排和位点突变等现象，这导致基因敲除和基因重组等操作的结果不一致。
因此，在酵母基因工程中，确保基因组的稳定性仍然是一个关键问题。
2. 效率和选择性：目前的酵母基因工程技术中，基因敲除和基因重组等操作的效率相对较低，并且选择性也较差，这限制了其在实际应用中的广泛推广。
重组法酵母转基因的操作流程
重组法酵母转基因的操作流程1.酵母基因组DNA的提取酵母基因组DNA提取的目的是获取酵母菌体内的DNA用于后续的操作。
一般采用裂解酵母菌体的方法提取DNA，具体步骤如下：-通过酵母预培养，得到酵母菌悬浮液。
-沉淀酵母菌悬浮液，去除培养基。
-使用细胞裂解缓冲液裂解酵母细胞，释放DNA。
-使用丙酮沉淀DNA，去除其他杂质。
-通过洗涤、溶解等步骤得到纯化的酵母基因组DNA。
2.外源DNA的构建外源DNA的构建是将目标基因或其他DNA片段经过特定的操作，构建成可用于转基因的载体DNA。
-针对目标基因，进行PCR扩增或使用其他适当的方法获得目标DNA片段。
-将目标DNA片段与载体DNA进行连接，一般采用限制酶切和DNA连接酶的方法。
-外源DNA还可以构建其他特殊序列，如启动子、标记基因等，以实现特定的目标。
3.酵母菌体的转化转化是将外源DNA导入酵母中，使酵母细胞能够表达外源基因。
酵母菌体转化一般有两种方法：化学法和电转化法。
-化学法转化：-制备酵母靶菌株，包括选择合适的酵母菌株及对应培养基成分的调整。
-制备产生低盐胆固醇溶液和转化缓冲盐溶液。
-稀释酵母导入质粉末，并加入充足的低盐胆固醇溶液。
-在冰上孵育一段时间，将混合液通过热激冷冻的方法转移到电泳气泡中。
-通过勺子串入导入液，冻结导入液后，电泳电环泵注入电泳。
-电泳过程中伴有导入液的减量。
结束电泳时，针尾切割成小片。
-电转化法转化：-将酵母细胞培养至对应的生长期。
-调整酵母细胞浓度。
-准备转化缓冲盐溶液和性相为空凝气泡的溶液。
-将酵母细胞和目标DNA溶液混合。
-通过不同电压的电击法将酵母细胞进行电转化。
-回收转化后的酵母菌体并进行培养。
4.筛选转基因酵母为了筛选出成功转基因的酵母细胞，一般采用标记基因的方法。
-构建一个可表达特定筛选标记基因的转基因酵母菌株。
-将转化后的酵母菌种悬浮液培养在含有选择性的培养基中，使只有转基因酵母能够存活下来。
-通过对菌落进行PCR扩增或其他方法，确认是否成功获得目标基因的酵母菌株。
基因工程 酵母单杂交技术的原理及应用
酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究。
在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。
将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游。
编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。
转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。
优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高。
缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。
如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。
酵母单杂交系统应用：1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。
Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。
2. 对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析.Mak et al（1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
o AOX1基因与AOX2基因序列相似，有92%的同源性， 其编码蛋白有97%的同源性，但AOX1基因的编码产 物在氧化过程起主要作用. o 甲醇能诱导AOX的合成，而甘油和葡萄糖则抑制AOX 的产生。 o 当细胞以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时不能检 测到AOX1的活性，而在甲醇培养的细胞中，该酶可 大量产生。 o 表达载体大多是利用AOX1启动子的强诱导性使它下 游的外源基因易于调控，并具有很高的表达量。
1．酿酒酵母自身的改造
⑴ 将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母，水解多糖
⑵ 将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母,水解 麦汁中蛋白 ⑶ 将β-葡聚糖酶基因导入酵母， 水解β-葡聚 糖 ⑷ 将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒 酵母体内表达，促进SO2产生 ⑸ 将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵 母
1
15.1.1 酵母基因工程的优点
① 是真核生物，大多具有较高的安全性； ② 繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工 程产品成作技术与真 核生物中复杂的转译后修饰能力相结合，能方 便地用于外源基因的操作； ④ 采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而 且可诱导调控； ⑤ 提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物与 天然蛋白一样或类似；
5
② 整合型载体
o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。 o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。
外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元 o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。 o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。 o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。 o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。
1．酿酒酵母表达系统
o 酿酒酵母很早就被应用于食品和饮料工业， 是发酵工业中的主要生产菌株，是人们最先 建立的酵母表达系统。 o 已发展和建立的酿酒酵母表达载体:附加型 和整合型。
⑴ 附加型表达载体
o 多为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达质粒 o 酵母部分：酵母菌的2μm质粒的复制区 o 选择元件：营养缺陷型相关的基因如LEU2、HIS4 和URA3基因。 o 表达盒式结构： 启动子：乙醇脱氢酶启动子PADH1、半乳糖诱导 型启动子PGAL； 分泌信号：酿酒酵母自身α-交配因子的分泌信 号； 终止子：CYC1基因的转录终止子。
② 选择标记 o 常用HIS4，以及ARG4、TRP1或URA3作选择标记 的载体。 o 巴斯德毕赤酵母不能利用蔗糖，所以可用来源 于酿酒酵母的蔗糖酶基因SUC2作为选择标记。 o 抗性选择标记有抗生素G418抗性基因和Zeocin 抗性基因（一种强诱变剂）。
16
leu-作为酵母载体的选择标记基因
15
酵母表达载体主要元件 ①启动子 o 最常用的启动子是基因AOX1的启动子，在它控制 下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达。 o PGAP（三磷酸甘油醛脱氢酶启动子）：在毕赤酵 母中克隆到的一个组成型启动子，在它控制下的 β-LacZ 基因表达率比甲醇诱导下的以PAOX1启动 的产量更高。 o PGAP不需要甲醇诱导，发酵工艺更为简单，又因 其产量很高，所以成为代替PAOX1的最具潜力的启 动子。
2．宿主
作为酵母表达系统的宿主应具备以下条件： 安全无毒，不致病 遗传背景清楚，容易进行遗传操作 构建的载体DNA容易进入，转化频率较高 发酵周期短，培养条件简单，容易进行高密度 发酵 ⑸ 蛋白质分泌能力良好 ⑹ 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功 能 o ⑴ ⑵ ⑶ ⑷
7
3．酵母的DNA转化
15.1.3 发展趋势
1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向 3．利用酵母基因工程筛选更多的新药 4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注
4
15.2 酵母表达系统
15.2.1 酵母表达载体
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。 o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。 o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列
12
甲醇酵母表达系统优点：
① 启动子强,且受甲醇严格诱导，因此可用于调控
② ③ ④ ⑤
外源蛋白的表达。 作为真核表达系统，能对重组蛋白进行翻译后必 要的剪接、折叠和修饰，糖基化也更接近高等真 核生物。 操作简单易行，但外源蛋白的表达量却比酿酒酵 母增加了10-100倍。 重组菌的遗传性质稳定，表达量和分泌效率高， 适于大规模发酵。 高密度培养干细胞量可达100g/L以上。
第15章
酵母基因工程
o 酵母基因工程的发展 o 酵母表达系统 o 酿酒基因工程的应用
15.1 酵母基因工程的发展
o 酵母菌是一类群体庞大的单细胞真核微生物， 种类繁多，至少包括80个属，600多种，10 000 多菌株。 o 酵母菌有完整的亚细胞结构和严谨的基因表达 调控机制，它既能通过有丝分裂进行无性繁 殖，也可通过减数分裂实现有性繁殖。
3
2．酵母表达异源蛋白
⑴ 表达水平 o 酵母的高效表达:通过开发高效的启动子提高 和控制外源基因的转录水平；提高表达载体在 细胞中的稳定性；通过多次同源重组以及介导 的整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝 数。 ⑵ 表达质量 o 提高酵母的遗传稳定性。 o 根据表达蛋白的不同，选用不同的酵母宿主。
⑥ 酵母菌可将表达的外源蛋白与末端前导肽融合，指 导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白 进行糖基化修饰； ⑦ 不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯； ⑧ 移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物使用中引起 免疫反应的问题； ⑨ 酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序， 它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对 表达产物的加工修饰及分泌能力； ⑩ 酵母可进行蛋白的N-乙酰化、C-甲基化，对定向到 膜的胞内表达蛋白具有重要作用。
（2）载体的复制形式
① 附加型载体 o 在酵母宿主中的拷贝数量大，但在传代过程中 易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。 o 两类： （1）利用酿酒酵母2μm质粒的DNA复制有关的 元件所构建，这类载体转化效率很高，每 μgDNA可得103-104个转化子； （2）利用酵母基因组DNA的自主复制序列，能 在酵母染色体外自主复制。
⑴ 原生质体法 转化效率不稳定，转化时间长、成本 较高。 ⑵ 离子溶液法 将酵母细胞用各种离子（如Cs＋、Li＋） 溶液进行处理，然后进行DNA转化，能明显增加外源 DNA的吸入。优点是操作简便、易掌握。 ⑶ PEG1000法 通过PEG处理酵母细胞获得类感受态再 转化。 ⑷ 电穿孔法和粒子轰击法（particle bombardment或 biolistics） 优点是转化效率最高，常用于一些新 的酵母宿主细胞的DNA转化。缺点是需要特殊的设备、 成本较高，所以不是常规的转化方法。
2
15.1.2 发展现状
o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。
10
图15-3 酿酒酵母rDNA介导的整合型分泌表达载体
启动子类型 诱导型 o PGAL在半乳糖存在的条件下表达水平提高1 000 倍，诱导表达GAL1、GAL7及GAL10基因产物占细 胞总蛋白的0.5%-1.5%，是常用的启动子。 组成型 o 用Kex2酶切去由重组蛋白与酵母α-交配因子的 前导序列融合的部分。 提高拷贝数： ① 用酵母转座子以产生多个插入拷贝； ② 通过rDNA介导的重组插入到核糖体DNA簇中在 宿主染色体上以约150个串联重复序列存在。
9
图15-2 酿酒酵母附加型表达载体
图15-2：酿酒酵母利用2μm质粒复制区的自主复制型表达载体 （1）pYES2：不带信号肽序列可在胞内或胞外表达 （2）pHBM363：带有信号肽的分泌表达载体
⑵ 整合型表达载体
o 没有在酵母中复制的质粒复制区，利用同源片 段将载体整合到染色体上。 o 与附加型载体一样，该类载体也有用于酵母转 化的选择元件和原核生物部分的复制起始序列 以及某种抗性基因。
4．酵母分泌外源蛋白的糖基化
o 不同酵母细胞对分泌蛋白的糖基化方式和程度 不同，加到分泌蛋白上的碳水化合物的长度和 结构是由酵母本身决定的。 o 酿酒酵母分泌的糖蛋白大多数是过度糖基化 （＞40个甘露糖残基） o 巴斯德毕赤酵母分泌的糖蛋白的寡糖链8-14个 甘露糖
8
15.2.2 常用酵母表达系统
6
NTS1 RFB 5S
NTS2 ARS 18S 35S 5.8S
25S
图15-1 酵母rDNA单元结构示意图
ARS: an autonomous replicating sequence RFB: a replication fork barrier NTS: non-transcribed regions