酵母基因工程培训课程(共41张PPT)
合集下载
高中生物 人教版 选择性必修三 基因工程整合 课件 (41张)
返回导航
第3章 基因工程
生物学（选择性必修3·RJ）
3．(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病
人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结
果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采
集病人组织样本。回答下列问题： (1) 若 要 得 到 正 确 的 检 测 结 果 ， 正 确 的 操 作 顺 序 应 该 是 __④__②__③__①__
返回导航
第3章 基因工程
生物学（选择性必修3·RJ）
解析：(1)PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测 结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样 本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。(2) 在 用 PCR 技 术 扩 增 DNA 时 ， DNA 的 复 制 过 程 与 细 胞 内 DNA 的 复 制 类 似，操作③中使用的酶是Taq酶(热稳定DNA聚合酶)，PCR 反应中的每 次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物 起始进行互补链的合成。(3)DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断， PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。(4)据分析可 知，PCR(多聚酶链式反应)技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段 的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
返回导航
第3章 基因工程
生物学（选择性必修3·RJ）
2．(2019·江苏卷)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传
给子代的是
(D)
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
15 酵母基因工程
1、酵母菌的转化程序
（1）酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。 但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳
多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位
基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 Ubc4 - ubc5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
第五节 酵母基因工程
三、 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
（3）泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA 1缺陷型：
2、转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制
不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体
这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总 数的50-80%
第五节 酵母基因工程
基因工程培训课件(ppt 49页)
高抗ⅹ矮病 F1 高抗 自交 F2（高抗、矮抗、高病、矮病）。
（6）简答选择能稳定遗传的新品种的方法。
为将止F。2矮秆抗锈病品种连续自交，分离淘汰提纯到基本不分离
生物材料：A小麦的高秆（显性）抗锈病（显性）纯种，B小
麦的矮秆不抗锈病纯种，C水稻的迟熟种子
非生物材
料：根据需要自选
方案2：
（1）育种名称：单倍体育种 （2）所选择的生物材料：A、B。 （3）希望得到的结果：矮秆抗锈病。 （4）预计产生这种结果的（所需类型）的几率：1/4。 （5）写出育种的简要过程（可用图解） 高抗ⅹ矮病 F1高抗 F加1花倍药成离为体纯培合养的高抗单、倍矮体抗植、株高，病再、经矮秋病水植仙株素。处理，染色体 （6）简答选择能稳定遗传的新品种的方法。 挑选矮秆抗锈病的植株即可。
8、基因工程中常用细菌等原核生物作 受体细胞的原因不包括( D )
A.繁殖速度快 B.遗传物质相对较少 C.多为单细胞，操作简便 D.DNA为单链，变异少
9、萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞，
获得了高水平的表达。这一研究成果表明
①萤火虫与烟草植物的DNA结构基本相
同 ②萤火虫与烟草植物共用一套密码子③
对应的内容，正确的组合是( C )。
供体
剪刀
针线
运载体
受体
A 质粒
限制性 核酸内 切酶
DNA连 接酶
提供目的基 大肠杆 因的生物 菌等
B
提供目的基 DNA连 因的生物 接酶
限制性 内切酶
质粒
大肠杆 菌等
C
提供目的基 因的生物
限制性 核酸内 切酶
DNA连 接酶
质粒
大肠杆 菌等
D
大肠杆菌等
DNA连 接酶
（6）简答选择能稳定遗传的新品种的方法。
为将止F。2矮秆抗锈病品种连续自交，分离淘汰提纯到基本不分离
生物材料：A小麦的高秆（显性）抗锈病（显性）纯种，B小
麦的矮秆不抗锈病纯种，C水稻的迟熟种子
非生物材
料：根据需要自选
方案2：
（1）育种名称：单倍体育种 （2）所选择的生物材料：A、B。 （3）希望得到的结果：矮秆抗锈病。 （4）预计产生这种结果的（所需类型）的几率：1/4。 （5）写出育种的简要过程（可用图解） 高抗ⅹ矮病 F1高抗 F加1花倍药成离为体纯培合养的高抗单、倍矮体抗植、株高，病再、经矮秋病水植仙株素。处理，染色体 （6）简答选择能稳定遗传的新品种的方法。 挑选矮秆抗锈病的植株即可。
8、基因工程中常用细菌等原核生物作 受体细胞的原因不包括( D )
A.繁殖速度快 B.遗传物质相对较少 C.多为单细胞，操作简便 D.DNA为单链，变异少
9、萤火虫的荧光素基因转入烟草植物细胞，
获得了高水平的表达。这一研究成果表明
①萤火虫与烟草植物的DNA结构基本相
同 ②萤火虫与烟草植物共用一套密码子③
对应的内容，正确的组合是( C )。
供体
剪刀
针线
运载体
受体
A 质粒
限制性 核酸内 切酶
DNA连 接酶
提供目的基 大肠杆 因的生物 菌等
B
提供目的基 DNA连 因的生物 接酶
限制性 内切酶
质粒
大肠杆 菌等
C
提供目的基 因的生物
限制性 核酸内 切酶
DNA连 接酶
质粒
大肠杆 菌等
D
大肠杆菌等
DNA连 接酶
酵母菌的基因工程课件
拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性 繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知 菌类，共由56个属和500多个种组成。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
第十二章 酵母基因工程-PPT精选文档
• 幻灯片 24
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导
第十五章 酵母基因工程
附加体型
整合型
酿酒酵母表达系统的不足： ①较难进行高密度发酵； ②蛋白质的分泌能力较差； ③过度的糖基化。
2、巴斯德毕赤酵母表达系统
优点：
①启动子强并受甲醇严格诱导
②对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基
化也更接近高等真核生物甚至人类。 ③甲醇酵母外源蛋白的表达量比酿酒酵母增加了10~100倍。 ④重组菌的遗传性质稳定，表达量和分泌效率高。 ⑤能高密度培养，干细胞量可达100克/升以上。
由于提前终止而不能有效转录；
②密码子是否符合甲醇酵母的偏好性； ③mRNA5’非翻译区的核苷酸序列和长度会影响到核 糖体40S亚单位对mRNA的识别； ④选取合适的宿主菌；
⑤产物自身的稳定性；
⑥甲醇酵母液体深层发酵时的培养条件是否合适。
3、酵母表面展示系统
基于a-凝集素的酵母细胞表面展示
基于α-凝集素的酵母细胞表面展示
3、染色体HIS4基因与载体的HIS4基因发
生置换。
（5）获得高拷贝整合转化子的方法
1、G418抗性水平筛选高拷贝 2、体外在载体上多次插入目的基因片段 3、宿主rDNA或其他非必需高重复的基因片段同 源重组 4、利用基因的功能筛选高拷贝整合
（7）提高外源基因在甲醇酵母中表 达的注意事项
①外源基因中A、T含量，许多高A+T含量的基因常会
第二节 酵母表达系统
一、酵母表达系统概述 1、酵母表达载体 （1）载体的基本构架
（2）载体的复制形式
附加体型： • 2m质粒：没有选择压力时不稳定。 • 自主复制序列ARS：有选择压力时，整个 群体的平均拷贝数变得很低，难以用于工 业生产。 整合型： • 同源序列：拷贝数低 • rDNA单元：拷贝数高
《酵母基因工程》PPT课件
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认 定为安全的基因工程受体系统。
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物； 将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性； 利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
测序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸 收 线 型 DNA 的 能 力 明 显 大 于 环 状 DNA， 二者相差80倍。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳 定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制 备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢ 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基 因的表达
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物； 将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性； 利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
测序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸 收 线 型 DNA 的 能 力 明 显 大 于 环 状 DNA， 二者相差80倍。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳 定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制 备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢ 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基 因的表达
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
2. 酵母菌克隆表达质粒的构建
（1）含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-
就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp
酵母菌是最简单的真核模式生物
第十五章 酵母基因工程
二、 酵母菌的宿主系统
1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌
4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
1、广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的
细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（
子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个
种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系 ，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
第十五章 酵母基因工程
一、 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 2、酵母菌表达外源基因的优势
STB
REP
B
1. 酵母菌中的野生型质粒
（2）乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同 的双链线状质粒pGKL1和pGKL1 拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒 素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g
2
1. 酵母菌中的野生型质粒
（1）酿酒酵母中的2m环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链 环状质粒，拷贝数达50至100个。 IRs 反向重复序列，600 bp，重组
RAF REP1
FLP
IR
A ori IR 同源重组
FLP 编码产物驱动IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质 粒类似。
能抑制超糖基化的突变类型 突变类型 生物效应 甘露糖生物合成缺陷型
mnn alg och
天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 外侧糖链添加缺陷型
4、减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
（1）泛素、介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys
HOOC
Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3 靶蛋白
上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养 后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
2. 酵母菌克隆表达质粒的构建
（2）含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的
基因工程受体系统（Generally Recognized As Saces cerevisiae）
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
毕赤酵母属
裂殖酵母属
如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pom
汉逊酵母属
如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
ose1
ssc11 rho-
提高重组蛋白表达
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
转录水平
羧肽酶Y 转录水平
3、抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧
链两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
第十五章 酵母基因工程
第十五章 酵母基因工程
一、 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 二、 酵母菌的宿主系统 三、 酵母菌的载体系统 四、 酵母菌的转化系统 五、 酵母菌的表达系统
六、 利用重组酵母生产乙肝疫苗
第十五章 酵母基因工程
一、 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 1、 酵母菌的分类学特征
对数生长期关闭 稳定期
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
（3）泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA 1缺陷型：
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤 表达外源基因最理想。
2、提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型 生物效应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 作用位点 钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平
ssc1 ssc2 rgr1
正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等
Ubc4 - ubc5 双突变型：
基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
第十五章 酵母基因工程
三、 酵母菌的载体系统
1
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
Lys
ubiquitin ligase E3
靶蛋白
Lys
蛋白酶
（2）酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期
UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期
UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期 UBI 4 编码泛素五聚体