酵母菌的基因工程课件
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酵母菌遗传课件
（2）ARS-结合蛋白
酿酒酵母复制的起始可能是通 过蛋白质与ARS相互作用而引 起的 。 与 ARS结合的蛋白有六种，分 子质量分别：120kD、72kD、 62kD 、 57kD 、 53kD 和 50KD, 这些蛋白以复合物的形式存在 并与 ACS结合，这种蛋白质复 合体称为起始识别复合物 （ORC）。 ORC 与 A 区结合，也与 B 区结 合。另外，Abflp也是一种主要 的 ARS结合的蛋白，能提高复 制效率。
一、酵母菌的基因组和染色体
二、酵母线粒体基因组及其遗传
三、酵母菌中的质粒
四、酵母基因表达的调控
五、接合型基因及其基因型转换
六、酵母菌的载体系统 七、酵母双杂交系统
第一节 酵母菌的基因组和染色体
一、酵母菌的基因组
1. 酿酒酵母的单倍体细胞含有16条染色体，总长度为12068kb，其中第Ⅰ条染色 体最短(230kb )，第Ⅳ条染色体最长(1532kb) 。
（3） ARS启动染色体复制的活性 酿酒酵母基因组中约有400个ARS，但并不是所有的ARS在原染色体上都具有 自主复制活性。可是，将这些染色体上的ARS克隆到质粒上后，却都有自主复 制活性。 S 前期
从使用的时序来看，可分为两类：
S 后期
位于不同位点表现的活性不同，靠近端粒的ARS，一般不表现活性。
（1） 自主复制序列ARS的结构 • 酿酒酵母中，ARS是长度为100~200bp、富含 A T 的DNA片段。 • 根据其在质粒中的稳定性，可分为三个结构域：其中A和B最为重 要
A结构域： 保守序列，称为ARS共有序列（ACS）。 所有ARS都含有一个完全相同或非常相似的ACS。ACS内单一碱基 的突变能降低或消除其起始功能。 B结构域： 位于ACS的3’末端，长度约80bp。 C结构域： ACS 的5‘末端，富含 AT ，C结构域间不具有同源性，也不 含共有序列。
酵母菌的基因工程
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1～5个
含有TEL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10～30倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制
不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体
这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总 数的50%～80%
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件 适用范围广，而且转化率可高达105 / mg DNA。
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1%～ 2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重 制约。 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
第8章 酵母基因工程
2 酵母载体的种类
酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体 酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体 用途 两类 酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分 酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分 复制形式 类。分为下列五类 ： 酵母整合型质粒YIp： 缺乏酵母的复制起始位点，不 ： 缺乏酵母的复制起始位点， 酵母整合型质粒 能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记ura3基因 能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记 基因 具有整合介导区， 所以， 。具有整合介导区， 所以，它只有整合到酵母染色体 中才能稳定(a)。 中才能稳定 。
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌， 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生 甲基营养菌 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。 甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。 表达系统优势： 表达系统优势： 生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因 生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1） 、可诱导表达 ） 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体， 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 上 外源基因序列一般整合入受体的染色体 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。 余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。 余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达
含有酵母菌染色体DNA同源序列的 同源序列的YIp质粒的构建 含有酵母菌染色体 同源序列的 质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 特定序列和标 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体 记基因，构建出来的质粒称为 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 。 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 特定序列中， 在染色体 特定序列中 酵母菌特定的染色体DNA区域。 区域。 酵母菌特定的染色体 区域
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性 繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知 菌类，共由56个属和500多个种组成。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
第十二章 酵母基因工程-PPT精选文档
• 幻灯片 24
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
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六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导
《酵母基因工程》PPT课件
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认 定为安全的基因工程受体系统。
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物； 将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性； 利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
测序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸 收 线 型 DNA 的 能 力 明 显 大 于 环 状 DNA， 二者相差80倍。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳 定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制 备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢ 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基 因的表达
不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等
幻灯片 7
解决内部降解的方法 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物； 将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性； 利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
测序
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势：全基因组测序，基因表达调控机理清楚，
遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
原生质体转化法的缺点： 操作周期长； 转化率受原生质再生率的严重制约。
2）碱金属离子介导转化法 酵 母 菌 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子 ( 如 Li+) 、
PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 特点：
共转化现象极为罕见；
吸 收 线 型 DNA 的 能 力 明 显 大 于 环 状 DNA， 二者相差80倍。
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳 定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低
• 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制 备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统
表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产
巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
毕赤酵母表达系统的特点
➢ 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基 因的表达
CHAPTER12酵母基因工程
的修饰功能
3.酵母的DNA转化方法
① 原生质体法 ② 离子溶液法(Cs+、Li+) ③ PEG1000法 ④ 电穿孔法和粒子轰击法
4.酵母分泌外源蛋白的糖基化
酿酒酵母：过度糖基化(＞40个甘露糖残基) 巴斯德毕赤酵母：8-14个甘露糖残基，分
泌的糖蛋白的聚糖末端不含1,3-连接的 甘露糖残基。 解脂耶氏酵母：8-10个甘露糖残基
主要应用于： 改造酵母本身提高发酵性能 利用酵母作为宿主表达异源蛋白
1.酿酒酵母的自身改造
(1)将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母 酿酒酵母只能利用单糖、双糖和麦芽三糖，
而占麦芽汁总糖25％的多糖和糊精不能 被利用，导致啤酒的高热量。 将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母中，可以 自身分泌葡萄糖淀粉酶，从而利用多糖和 糊精。
程中极易被破坏，同时啤酒中残留的β-葡 聚糖易引起过滤困难，形成冷凝物、沉淀 物和胶凝等问题。 将β-葡聚糖酶基因导入酵母，可以有效降解 麦芽汁中的β-葡聚糖，改善啤酒的过滤效 率。
1.酿酒酵母的自身改造
(4)将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在 酿酒酵母体内表达，可以促进SO2的生成 ，可以维持啤酒风味的稳定。
两种方式提高拷贝数
① 用酵母转座子以产生多个插入拷贝 ② 通过rDNA介导的重组插入到核糖体
二、常用酵母表达系统
1.酿酒酵母表达系统 附加型载体：
① 原核部分包括pUC质粒的复制起点和amp+筛选 标记；真核部分包括酵母菌的2μm质粒的复制 区和营养缺陷型相关基因。
② 启动子常用乙醇脱氢酶启动子PADH1，半乳 糖诱导型启动子PGAL，分泌信号为自身α-交 配因子，终止子用CYC1基因的转录终止子。
(5)将人血清清蛋白HAS基因转化到酿酒酵 母，可以生产富含HAS的啤酒新品种。
3.酵母的DNA转化方法
① 原生质体法 ② 离子溶液法(Cs+、Li+) ③ PEG1000法 ④ 电穿孔法和粒子轰击法
4.酵母分泌外源蛋白的糖基化
酿酒酵母：过度糖基化(＞40个甘露糖残基) 巴斯德毕赤酵母：8-14个甘露糖残基，分
泌的糖蛋白的聚糖末端不含1,3-连接的 甘露糖残基。 解脂耶氏酵母：8-10个甘露糖残基
主要应用于： 改造酵母本身提高发酵性能 利用酵母作为宿主表达异源蛋白
1.酿酒酵母的自身改造
(1)将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母 酿酒酵母只能利用单糖、双糖和麦芽三糖，
而占麦芽汁总糖25％的多糖和糊精不能 被利用，导致啤酒的高热量。 将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母中，可以 自身分泌葡萄糖淀粉酶，从而利用多糖和 糊精。
程中极易被破坏，同时啤酒中残留的β-葡 聚糖易引起过滤困难，形成冷凝物、沉淀 物和胶凝等问题。 将β-葡聚糖酶基因导入酵母，可以有效降解 麦芽汁中的β-葡聚糖，改善啤酒的过滤效 率。
1.酿酒酵母的自身改造
(4)将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在 酿酒酵母体内表达，可以促进SO2的生成 ，可以维持啤酒风味的稳定。
两种方式提高拷贝数
① 用酵母转座子以产生多个插入拷贝 ② 通过rDNA介导的重组插入到核糖体
二、常用酵母表达系统
1.酿酒酵母表达系统 附加型载体：
① 原核部分包括pUC质粒的复制起点和amp+筛选 标记；真核部分包括酵母菌的2μm质粒的复制 区和营养缺陷型相关基因。
② 启动子常用乙醇脱氢酶启动子PADH1，半乳 糖诱导型启动子PGAL，分泌信号为自身α-交 配因子，终止子用CYC1基因的转录终止子。
(5)将人血清清蛋白HAS基因转化到酿酒酵 母，可以生产富含HAS的啤酒新品种。
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拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
RAF STB
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
粒类似。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
B
FLP REP2
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同 的双链线状质粒pGKL1和pGKL1
DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基
以ARS为复制子的质粒称为YRp 以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代 后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1～5个
链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白
能抑制超糖基化的突变类型
质的糖基化系统，但野生 突变类型
生物效应
型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 超糖基化倾向，因此超糖 基化缺陷株非常重要。
mnn alg och
甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 外侧糖链添加缺陷型
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
D 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1%～ 2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重 制约。
含有TEL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因， 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定 序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区 域。
7 酵母菌的基因工程
基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物
7 酵母菌的基因工程
B 酵母菌的宿主系统
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：
酵母属
如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
毕赤酵母属 裂殖酵母属
如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
Ubc4 - ubc5 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
7 酵母菌的基因工程
C 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2m环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链
环状质粒，拷贝数达50至100个。
IRs 反向重复序列，600 bp，重组 FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点
汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母 表达外源基因最理想。
提高重组蛋白表ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型
ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho-
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的