B16细胞培养
二甲双胍和顺铂联用对B16F10黑素瘤细胞的协同抑制效应_梁官钊
黑素瘤是一种黑素细胞来源的高度恶性肿瘤 ， 其 发病隐匿、 转移早、 致死率高， 死于皮肤肿瘤的患者约 80% 为黑素瘤患者
［1 ］
超过 1． 2 亿个
［3 ］
。然而， 现在二甲双胍的抗癌作用正
。 黑素瘤自皮肤形成远端转移
为我们所认识。流行病学研究显示， 二甲双胍降低了 ［4 ］ ［5 ］ 糖尿病患 者 的 患 癌 风 险 和 癌 症 患 者 的 死 亡 率 。 顺铂是临床治疗多种实体瘤的一线用药之一 ， 具有抗 ［6 ］ 癌谱广、 疗效确切等特点 。 临床上， 顺铂经常同其
用效果。
［作者单位］ 1． 承德医学院附属医院皮肤科 ， 河北 承德 067000 ； 2． 承德医学院基础研究所 ， 河北 承德 067000 ； 3． 承德医学院附属医院中心实验 室， 河北 承德 067000 ［通讯作者］ 陆洁， Email： chengdejiel@ 163． com
中国皮肤性病学杂志 2015 年 1 月第 29 卷第 1 期
［ DOI］ 10． 13735 / j． cjdv． 10017089． 2015． 0016 Combination of Metformin with Cisplatin Showed Synergistic Antitumor Effect on B16 F10 Melanoma Cells LIANG Guanzhao1 ， LI Baoqiang1 ， HAN Chenzhu1 ， XU Qian2 ， YANG Ning3 ， XING Enhong3 ， LU Jie1 （ 1 ． Department of Dermatology， Affiliated Hospital of Chengde Medical College， Chengde 067020 ， China； 2 ． Basic Medical Institute of Chengde Medical College， Chengde 067020 ， China； 3 ． Department of Central Laboratory， Affiliated Hospital of Chengde Medical College， Chengde 067020 ， China） ［ Corresponding author］ LU Jie， Email： chengdejiel@ 163． com ［ Abstract］ Objective To investigate the effect of combination therapy of cisplatin and metformin on B16F10 melanoma B16F10 melanoma cells were cultured in vitro and treated with indicated concentrations of The vitality of B16F10 melanoma cells were significantly cells． Methods
B16细胞的培养
细胞增殖快非常好养，但是要及时换液，否则也很容易死亡、或变形。
我养的最
好的时候，天天都在换液，两三天就要消化传代。
我用的消化液一般是消化用
含EDTA的胰酶0.25%，个人感觉效果比较好一点。
消化步骤：吸出培养液，加入PBS洗涤（视培养瓶大小加入相应的量，25CM加
入1-2ML）而后加一次胰酶（25CM培养瓶加0.6ML）作用 2-3分钟，轻轻摇晃使
均匀作用在细胞层面上。
要一直在显微镜下观察，以防消化过头，等细胞从梭形
变成椭圆形（或是棱角变钝），本来连成片的细胞之间开始有小小的空间，细
胞与细胞好象是一粒粒的，界限清楚，这时是消化的最佳时机。
（细胞的活力最
好，又非常容易吹打）加入培养液进行吹打十几次即可。
如果消化到细胞全部飘起来，就消化的稍微有点过了。
如果细胞的形态还是老样
子，就消化的有点不足，吹打起来十分费力，有大片的细胞就会贴在壁上，起不
来，而且很不均匀。
只好重新加胰酶消化。
还有就是细胞长的比较密时，胰酶可以比平时多加一点，消化时间适当延长。
雅吉货号中文名称英文名称种属组织来源形态学生长方式培养基血清
YJ255 小鼠黑色素瘤细
胞
B16 小鼠黑素瘤
成纤维细胞
样
贴壁RPMI-1640 C S
B16用加10%血清，加双抗的RPMI-1640培养液，0.25%胰酶消化对数生长期B16细胞，传代比约1:5.
倒置相差显微镜下，对数生长期品源B16细胞形态为梭形或不规则形。
白藜芦醇美白功效的初步研究
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ
ｔｏ
ｔｈｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＩ ６ ｍｅｌａｎｏｅｙｔｅ。ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ｏｆ
ｃｅｌｌｕｌａｒ
ｉｌｇ／ｍＩ。ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈａｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｆｆｅｃｔ ｗｉｔｈ ５０ ｐｇ／ｍＩ。ａｒｂｕｔｉｎ ａｎｄ ｅｔｈｙｌ Ｖｃ． ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｗｈｉｔｅｎｉｎｇ
ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：
血
白藜芦醇美自
酪氨酸酶黑色素 ｔｈｅ
Ａ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｏｎ
Ｗｈｉｔｅｎｉｎｇ
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ＺＨ（）【ｒ Ｈｕａｆｅｎ９２
ＳＨＪ ＸｉａｎｍｉｎⅢ
ＹＡＮ Ｚｅｒｎｉｎ２
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ＨＥ Ｈｏｎｇｘｕａｎ３
Ｄ【，ＡＮ
Ｍｉｎｇｘｉｎ９１
白藜芦醇美白功效的初步研究
１．生物膜与膜生物工程国家重点实验室，清华大学生命科学
学院。北京
１０００８４；
２．江苏隆力奇生物科技股份有限公司研发中心，常熟２１５５５５； ３．中国科学院动物研究所，北京
１００１０１
………………………………史先敏“２ …………………………………周华锋２
严泽民２谢静红２ 何宏轩３ 段明星１
研究了白藜芦醇对Ｂ１６黑色素细胞的增殖、细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响。结果表明．白藜芦醇可抑制细胞
非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用.
非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用[ 07-09-17 10:40:00 ] 编辑：studa20作者：赵学铭，刘易欣，倪春生，赵秀兰，孙涛，古强，孙保存【关键词】 ,间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养,［摘要］目的研究与恶性黑色素瘤细胞进行非接触式共培养的间充质干细胞表型变化，从而明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞之间相互作用的研究。
方法利用Transwell进行非接触式共培养，分析间充质干细胞形态变化，利用免疫组织化学与免疫荧光检测其Ⅷ因子和CD34表达。
结果间充质干细胞在非接触式共培养体系中可以被恶性黑色素瘤细胞诱导为多角形或短梭形，同时Ⅷ因子和CD34表达上调。
结论初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的间充质干细胞中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。
［关键词］间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system［Abstract］ Objective To study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.Methods Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determination of the expression of Ⅷ factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.Results MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show Ⅷ factors and CD34 was upregulation of MSC.Conclusion The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculturesystem may used in cell interaction research in vitro.［Key words］ mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是指存在于骨髓基质中的非造血组织的另一类重要的干细胞，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力，又具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能［1,2］。
12746422_2-甲氧基雌二醇对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响__
好标记,将 24 孔 板 放 入 孵 箱 内 继 续 培 养 24h。 进
行细胞染色,显微镜下细胞计数。
1.
3.
4 Tr
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l法检测 细 胞 的 迁 移 情 况 实 验 步
骤基本同上述的 Tr
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l细胞侵袭实验,区别为:
① 无需包 被 Ma
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l胶,在 小 室 内 直 接 接 种 细 胞;
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l方法观察 药 物 在 体 外 对 细 胞 趋 化 侵 袭 能
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力的影响。观察药物在体外对细胞迁移能 力 的 影 响。 细 胞 划 痕 实 验 观 察 经 10μmo
l
-ME 处 理 MM B16 细 胞
24h 后划痕愈合程度。结果 与对照组比较,不同浓度 的 2
-ME 处 理 MM B16 细 胞 后 克 隆 形 成 率 差 异 有 统 计 学 意
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培养基诱导B16细胞黑色素合成及机理研究
Ｇｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｎｏ ． ９ ２
培养基诱导 Ｂ Ｉ ６细胞黑色素合成及机理研究
陈金妹 ， 林进妹 ｚ ， 黄 家福 ， 欧一新 ， 曹 娜 ， 张 秀芬 １ ， 朱祯 慧 ， 潘裕添
ｆ １ ． 闽南师范大学 茵物产业工程技术 中心， 福建 漳州 ３ ６ ３ ０ ０ ０ ， ； ２ ． 闽南师范大学 化 学与环境 学院， 福建 漳州３ ６ ３ ０ ０ ０ ）
细 胞 中三 种 黑 色 素合 成 相 关 蛋 白质 （ Ｔ ｙ ｏｓ ｒ ｉ ｎ ｓｅ ａ ， Ｔ ｙ ｒ ｏ ｓ ｉ ｎ ｓｅ ａ — ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ １ 和Ｔ ｙ ｍｓ ｉ ｎ ｓｅ ａ － ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ２ ） 在 以上 两 种 培 养 基 中表 达 的 差异 。 发 现 这 三 种蛋 白质 的 ｍＲ Ｎ Ａ转 录水 平 基 本 没 有 差 异 ， 在Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ — Ｄ ＭＥ Ｍ一 １ ２ ８ ０ ０培 养 基 中这 三 种 蛋 白质 的翻 译 水 平 均 明 显提 高 ， 总蛋 白 质 组 也 更 加 多样 ． 结论： Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ — Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ－ １ ２ ８ ０ ０培 养 基 通 过 提 高
Ｃ ＨＥ Ｎ Ｊ ｉ ｎ — ｍｅ ｉ ， Ｌ Ｉ Ｎ Ｊ ｉ ｎ — ｍｅ ｉ ， ＨＵＡＮＧ Ｊ ｉ ａ — ｆ ｕ ， ＯＵ Ｙｉ — ｘ ｉ ｎ ， Ｃ ＡＯ Ｎａ ， Ｚ ＨＡＮＧ Ｘｉ ｕ － ｆ ｅ ｎ ，
中华眼镜蛇毒组分C对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用
中华眼镜蛇毒组分C对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用目的：研究中华眼镜蛇毒组分C（FC）对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用。
方法：采用MTT比色法、生长抑制实验、集落形成实验，探讨FC对小鼠B16黑色素瘤细胞株的毒性作用。
结果：FC对B16细胞有明显的毒性作用，处理细胞48 h，其IC50=1.75 μg/ml。
FC处理B16细胞24、48、72 h后，各时间点的细胞存活数随FC的浓度升高而减少，细胞的生长受到抑制。
FC还显著抑制B16细胞的集落形成，当FC浓度为0.5、1.0、2.0 μg/ml时，其抑制率分别为33.42%、50.57%、77.34%。
结论：中华眼镜蛇毒组分C对B16细胞具有明显的细胞毒性和生长抑制作用。
标签：中华眼镜蛇毒；黑色素瘤；细胞毒眼镜蛇是我国南方常见的毒蛇之一，据文献报道，眼镜蛇毒对多种肿瘤细胞有较好的杀伤作用。
中华眼镜蛇毒组分C是从中华眼镜蛇毒中分离出的具有明显抗癌活性的组分，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带，分子量约6000 Da[1]。
以往研究表明眼镜蛇毒组分C体内外都具有较好的抗白血病和其他肿瘤作用[2-6]。
本文探讨了其对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞株的毒性作用。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株小鼠B16黑色素瘤细胞株由广州医学院实验中心提供。
1.1.2 主要试剂噻唑蓝（MTT）：SIGMA产品；二甲基亚枫（DMSO）：天津市化学试剂一厂（分析纯）；RPMI1640：GIBCO产品；新生牛血清：杭州四季青生物工程有限责任公司。
1.1.3 中华眼镜蛇毒组分C（fraction C from naja naja actra venom，FC）由广州蛇毒研究所提供。
1.1.4 主要仪器SW-CJ-1F型洁净工作台：苏净集团安泰公司；自动化酶免分析仪：北京圣健北方医疗仪器有限公司；CO2培养箱：美国QUEUE，Stabil therm；倒置显微镜：重庆光学仪器厂。
侧群分析操作方法
●重悬液（A液）的配制：向RPMI1640培养基中加入2%胎牛血清和10 mM HEPES ●重悬液（B液）的配制：向PBS 缓冲液中加入2%胎牛血清和10 mM HEPES
1.侧群细胞（Side population cells，SP）是利用流式细胞术和Hoechst 染料
进行造血干细胞分离时发现的一群特殊的细胞，这群特殊的细胞具有类似干细胞的自我更新和多向分化的能力。
2.取处于对数生长期的B16F10 细胞制成单细胞悬液，以3 ×105个/孔的
细胞量接种于6 孔板内，置于37 ℃，5% CO2 培养箱中培养过夜。
3.实验分为6 个组别：阳性对照（维拉帕米）组、空白对照组、Das（16.67
μmoL/L）组、ATRA（16.67μmoL/L）组、Das+ATRA（16.67 μmoL/L）组、Das/ATRA-NPs（16.67 μmoL/L）组。
每孔加入750 μL 药液，阳性对照组和空白对照组加等量的RPMI 1640 培养基。
4.药液与细胞共同培养24 h 后，阳性对照组加入浓度为100 μg/mL 的维拉
帕米处理20 min。
弃去孔内药液，PBS 缓冲液洗涤细胞2 次，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞。
5.每组各加入1 mL 预热至37 ℃的重悬液（A 液）重悬细胞，再加入5 μL
Hoechst 原液，37 ℃水浴避光孵育90 min。
反应90 min 后，立即用预冷的PBS 缓冲液洗涤细胞2 次，1000 rpm离心5 min 收集细胞。
6.再用预冷的重悬液（B 液）重悬细胞，加入2 μL PI 染色液，充分混匀
后，采用流式细胞仪进行检测分析。