淋巴瘤基因克隆性重排检测.ppt
淋巴瘤基因克隆性重排检测
专注分子诊断 精|选 引领精准医学
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基于不同方法的产品系列-Invivoscribe公司
基于PCR检测技术，简便、快 速、成本较低，所需DNA量少， 对DNA质量要求不高。灵敏度 高于10%，需配制胶，安全清 洁性较差。
基于PCR-毛细管电泳检测技术， 敏感性高，检测周期较长，结 果更加直观可靠
目前市场最被接受的检测方法。 灵敏度无法满足MRD要求，难 以定量和得到序列。
恶性淋巴瘤发生的过程
单克隆性
突出单一形式的基因重排
IGH, TRB & TRD: V, D, and J IGK, IGL, and TRG: V and J regions
专注分子诊断 精|选 引领精准医学
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淋巴细胞克隆性基因重排检测的临床意义
5%～15%的病例表现复杂，即使做了大量的免疫标志也可能难以鉴别其良恶性，需要进一步的手段区分。 利用分子生物学手段分析Ig和TCR基因的克隆性重排被WHO公认为该疾病诊断手段的重要补充。
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Biomed-2研究项目（IGH为例）
专注分子诊断 精|选 引领精准医学
van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 17: 2257.
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Biomed-2研究项目（IGH为例）
专注分子诊断 精|选 引领精准医学
van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 17: 2257.
IdentiCloneTM系列产品具有精心优化的标 准化试剂组成，具有最丰富的阳性对照，涵盖 各种T\B细胞重排类型，经过了超过400例的临 床样本验证，按照临床产品的标准进行质检和 质控，反应体系稳定，结果可靠。
t细胞淋巴瘤tcrγ基因重排特征的分析及检测方法优化
Ｔ细胞淋巴瘤ＴＣＲＴ基Ｎ重排特征分析及检测方法的优化摘要研究背景与目的淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难，容易造成误诊。
淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。
目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。
随着分子生物学的发展，从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟，为淋巴瘤诊断提供了有效工具。
淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致，而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞，这是二者的重要区别。
编码免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）的基因经过重排以后，不同克隆之间的重排基因互不相同，因此，基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。
以ＰＣＲ技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。
但不同研究文献中所采用的引物、ＰＣＲ条件、ＰＣＲ产物检测方法等都不尽相同，结果也有差异。
因此，难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。
Ｊｕｒｋａｔ细胞是Ｔ细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞，但有关Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排的详细情况也未见报道。
假基因是Ｉｇ和ＴＣＲ胚系ＤＮＡ中常见的基因，有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。
本实验以ＴＣＲ基因重排为研究对象，通过优化引物选择、ＰＣＲ条件及ＰＣＲ产物的检测方法等，分析Ｔ细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。
同时，分析ＴＣＲ基因重排的特点，为进一步研究ＴＣＲ基因重排提供理论和技术支持。
方法１以ＴＣＲｙ基因重排为研究对象，选用通用引物ＴＶＧ、ＶｖＩ及ＴＣＲ７家族特异性引物为工具。
用正交设计实验优化ⅥＩ引物的ＰＣＲ条件。
另选一对ＴＣＲ［ｊ通用引物作为ＴＣＲｙ引物的补充和比较。
２利用ＰＣＲ和测序研究Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排情况，分析ＴＣＲ基因重排的基本特点。
３ＰＣＲ产物检测方法①利用ＴＣＲ通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重排阳性率，分别用琼脂糖电泳和ＳＳＣＰ分析ＰＣＲ产物；②将ＰＣＲ产物分别进行直接测序和克隆后测序，分析ＴＣＲ基因重排的特点及探索测序方法在基因重排检测中的应用；⑧分析ＰＣＲ产物中ＤＮＡ的克隆数与ＳＳＣＰ中条带数目的关系。
淋巴瘤分子诊断课件
IgH基因重排、转录和翻译步骤
5’
V1 V2 V3 Vn D1 D2 D3 Dn J1 J2 J3 Jn Cm Cd Cg C…
3
1. D-J 结合(不完全 DNA 重排)
5’
V1
V2
V3
Vn
D1 D2 J2
J3
Jn
Cm
Cd
Cg
C…
3’
2. V-DJ 结合(完全 DNA 重排)
5’
V1
V2
D2 J2
Igμ 重链和一个轻链组装后形成一个有界膜 的IgM，表达在不成熟的B-细胞表面。
T-细胞受体重排：
T-细胞受体(TCR)链就像上述的Ig基本相同的方式进行 有序的重组。首先在TCRβ链进行D到J重组。这个过程 不是Dβ1 基因片段与6个Jβ1片段中一个结合，就是Dβ2 基因片段与7个Jβ2 片段中一个结合。DJ重组后接着是 Vβ-到-DβJβ重排。在新形成的Vβ-Dβ-Jβ复合体中间的 所有基因被删除掉，并与恒定区基因（Vβ-Dβ-Jβ-Cβ） 结合后进行初级转录。mRNA转录拼接外面任何插入的 序列和允许翻译全长TCR Cβ链。
主要目的：（1）开发和标准化PCR实验操作和PCR引物 （2） 评价和应用该标准化方法
设计了一套完整的引物和方法用于IG和TCR 基因重排的克隆性分析，共有14管97对引物
IGH（A,B,C,D,E 5管） IGK（A，B 2管） IGL（1管） TCRB（A，B，C 3管） TCRG（A，B 2管） TCRD(1 管)
免疫球蛋白（Ig）示意图
Ig/TCR结构
• 免疫球蛋白重链含有44个可变区（V）基因加上
27个高变区（D）基因和6个结合区（J）基因。
2024版CSCO淋巴瘤诊疗指南解读PPT课件
基因突变检测与预后评估
基因突变检测有助于 精确诊断淋巴瘤亚型 ，指导个体化治疗。
基因突变检测可预测 患者对特定治疗方案 的敏感性和耐药性。
某些基因突变与淋巴 瘤的预后密切相关， 如TP53、MYC等基 因的突变。
新型标志物发现及其临床意义
新型标志物的发现为淋巴瘤的 早期诊断、预后评估和靶向治 疗提供了新思路。
疼痛管理
对于淋巴瘤患者可能出现的疼痛症状，进行 有效的疼痛管理。
营养支持
根据患者的营养状况，提供个性化的营养支 持方案。
并发症预防与处理
积极预防并处理化疗、放疗等治疗过程中可 能出现的并发症。
05
药物治疗进展及耐药问题解决 方案
化疗药物使用注意事项
化疗药物的分类与选择
根据淋巴瘤的病理类型、分期和患者身体状况，选择合适的化疗药 物。
对于有高危因素的人群，应定期进行体检和筛查，以便早期发现和治疗淋巴瘤。
临床表现及诊断方法
淋巴瘤的临床表现多种多样，包括无痛性淋巴结肿大、肝脾肿大、发热 、盗汗、消瘦和瘙痒等全身症状。
诊断方法主要包括病理学检查、影像学检查、血液学检查和分子生物学 检查等。其中，病理学检查是确诊淋巴瘤的金标准，包括淋巴结活检、 穿刺活检和骨髓活检等。
以及它们的作用机制和疗效。
靶向药物的临床应用与前景
02
探讨靶向药物在淋巴瘤治疗中的临床应用情况，以及未来的发
展方向和前景。
靶向药物的耐药性及解决方案
03
分析靶向药物产生耐药性的原因，并提出相应的解决方案。
免疫治疗在淋巴瘤中应用前景
免疫治疗的原理与种类
介绍免疫治疗的原理，以及针对淋巴瘤的免 疫治疗种类，如CAR-T细胞疗法、PD-1抑 制剂等。
lymphoma淋巴瘤 ppt课件
皮肤：肿块、皮下结节、浸润性斑块，溃疡 肝脾肿大
3. 全身症状：发热、盗汗、消瘦。
五、实验室及辅助检查
（一）淋巴结或病变组织活检
诊断淋巴瘤主要依据 详细分型, 难度大 取材
（二）实验室检查
HL 1．血液：正常→贫血 wbc正常或↑，全血细胞减少 2．骨髓：部分病人可查到R-S 细胞 3．其他：血沉快，LDH↑，
• cyclin D1
+
• CD10 (blastoid) -
CD5
• CD23
-
基因特征
• t(11;14) • BCL-1 rearranged
CD1 9
CD10
6 、 皮 肤 T 细 胞 淋 巴 瘤 ： （ Cutaneous Tcell lymphoma）蕈样肉芽肿（Mycosis fungoides）。
淋巴组织肿瘤WHO分型
霍奇金淋巴瘤
B细胞淋巴瘤
T/NK细胞淋巴瘤 组织细胞和树突细胞肿瘤
非霍奇金淋巴瘤
移植后淋巴组织增殖性疾病
(应用新技术手段如单抗，细胞遗传学和分子生 物学等，分出许多新的类型)
霍奇金淋巴瘤
结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤 经典型霍奇金淋巴瘤(95%)
富于淋巴细胞型 结节硬化型 混合细胞型 淋巴细胞消减型
4、B-慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤
形态特点
• 小淋巴细胞 • 增殖中心（区） 免疫表型
• surface IgMD weak
• CD19, 20, 79a
+
• CD5
+
• CD23
+
• CD10, CycD1
-
遗传学特征
用IgH、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变(精)
用IgH、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变【摘要】目的探讨IgH 、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变的意义。
方法采用IgH、TCR β、TCR γ基因重排标志检测，36例经常规HE、免疫组化不能诊断的疑难淋巴组织增生性病变，并进行克隆性分析。
结果29例淋巴组织增生性病变呈克隆阳性，其中IgH、TCR双重排阳性者为13例，IgH单一阳性8例，TCR单阳性为8例。
克隆阳性病例与免疫组化结果一致的为24/29例，7例阴性者，4例为反应性增生，2例经随诊为猫抓病淋巴结炎，1例为不典型增生。
结论 IgH、TCR基因重排技术对于疑难淋巴组织增生性病变的诊断和鉴别诊断有较大的意义。
【关键词】淋巴瘤基因重排;诊断Detecting Problematic Proliferative Lesions of Lymph Tissue by IgH and TCR Gene Rearrangement TechniqueZHONG Mei, LV Ya li, LI Bing, ZHAO PoDepartment of Pathology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, ChinaAbstract：Objective To investigate the significance in diagnosis of problematic proliferative lesions of lymph tissue by IgH, TCR gene rearrangement technique.Methods Thirty six cases of proliferative lesions of lymph tissue with diagnostic difficulty by routine HE and immunohistochemistry, were analyzed in detail by PCR based IgH, TCR gene rearrangement technique to further determine the diagnosis. 20 cases of previously diagnosed lymphoma and 10 reactive lymphadenitis were used as a positive control and negative control, respectively.Results All control samples of lymphoma were positive for clonal rearrangement. 29/36(80.6%)cases of problematic lesion showed positive for clonal proliferation in which those positive for both IgH and TCR were 13/29(44.8%), for single,IgH 8/29(27.6%)or TCR 8/29(27.6%), respectively; and those positivity associated with immunohistochemistry were 24/29(82.8%). In seven cases negative for clonal rearrangement, 4 were reactive proliferation，2 Cat scratch lymphadenitis and 1 atypical proliferation.Conclusion It is significantly useful to solve the problems in differentiating diagnosis of elusive proliferative lesions of lymph tissue, by IgH, TCR gene rearrangement analysis.Key words：Lymphoma; Gene rearrangement; Diagnosis0 引言本研究应用IgH、TCR β、TCR γ基因重排技术对36例疑难淋巴组织增生性病变进行分析，以探讨实际工作中解决疑难问题的可能性及意义。
女性患者下生殖道淋巴组织高度反应性增生(淋巴瘤样病变)：一种具有免疫球蛋白重链克隆性基因重排的良
者 的传染病史 ， 新鲜组织 未经 固定 传染性极 强 ， 冷冻操 作时
要 养 成 戴 手 套 的 习惯 。遇 到 肝 炎 或 梅 毒 患 者 的标 本 时 ， 冷 在
透性好 ， 但极易挥发且有 异味 ， 应用 时要 随时盖 紧容 器。我 们建议使用 ９ ％ 乙醇 固定 １～２ ｍ ｎ 固定 时 间短 ， 果 甚 ５ ｉ， 效
［ 骆 新 兰 ． 冻 切 片常 见 问题 探 讨 ［ ］ 临床 与 实 验 病 理 学 杂 志 ， ４］ 冷 Ｊ．
１９ ，５ ４ ：７ ． ９ ９ １ （ ） ２３
・
国外期刊文摘 ・
女 性 患 者 下 生 殖 道 淋 巴组 织 高 度 反 应 性 增 生 （ 巴 瘤 样 病 变 ） 一 淋 ： 种具 有 免 疫 球 蛋 白重 链 克 隆 性 基 因重排 的 良性 病 变
［ ］ 陈乐真． ３ 手术 中 病 理 诊 断 ［ ］ 北 京 ： 民军 医 出版 社 ，９ ４ Ｍ ， 人 １９ ：
５．
觉与石蜡切片反差不大 ， 这样 的切 片才是 一张合格的冷冻切
片， 只有 这 样 的切 片 才 能 为 快 速 而 准 确 的诊 断 提供 保 障 。 ３８ 关于消毒及清洁 ． 病 理 科 在 预 约 冷 冻 时 一 定 要 了 解 患
８１ ．
习惯 ， 以便 总 结 经 验 。镜 下 观 察 胞 质 与 胞 核 应 红 蓝 对 比鲜 明， 细胞 无 明 显 收 缩 ， 织 无 人 为 裂 隙 ， 有 或 极 少 形 成 冰 组 没 晶， 刀痕 少 ， 要 观 察 的 肿 瘤 或 组 织 结 构 能 较 完 整 地 呈 现 ， 主 感
临床 与实验病理 学杂志
ＪＣｉ ｘ ａｈｌ ００Ｊｎ ２ （ ） ｌ Ｅｐ Ｐ ｔｏ ｎ ２ １ ａ ；６ １
克隆性基因重排检测用于诊断B细胞淋巴瘤微小病灶
克隆性基因重排检测用于诊断B细胞淋巴瘤微小病灶施纯玫;陈强【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2006(040)002【摘要】目的探讨B细胞淋巴瘤(B-NHL)外周血及骨髓克隆性基因重排检测对微小病灶(MD)的诊断价值.方法应用PCR技术,扩增IgH、bcl-2/IgH(包括MBR及MCR)基因重排,对42例治疗前B-NHL患者外周血及骨髓同时进行MD检测,对照组为25例非B-NHL.用IgH基因重排阳性的淋巴瘤CA46细胞株作系列稀释法实验,判断以IgH为分子标志检测外周血及骨髓MD实验的灵敏度.结果淋巴瘤CA46细胞株系列稀释法实验显示:以IgH基因重排为分子标志检测MD敏感性为10-2.42例B-NHL外周血中IgH检出率19% (8/42),bcl-2/IgH检出率为33.3%(14/42).对42例B-NHL同时进行的骨髓MD检测中,IgH检出率为28.6%(12/42),bcl-2/IgH MBR检出率为45.2%(19/42).外周血及骨髓中T细胞淋巴瘤及其他淋巴瘤3种指标检测均为阴性.IgH、bcl-2/IgH MBR、bcl-2/IgH MCR 3个指标各自在骨髓中检出率与外周血中检出率差别无统计学意义(P>0.05),虽然bcl-2/IgH MBR检出率在外周血与骨髓中滤泡性淋巴瘤(FCL)组均较弥漫性大B细胞淋巴瘤组高,但差别无统计学意义(P>0.05).在同时进行的外周血及骨髓检测中,12例骨髓IgH阳性中有8例外周血检测亦为阳性,19例骨髓bcl-2/IgH MBR 阳性中有13例外周血检测为阳性,但1例FCL骨髓检测阴性外周血检测为阳性.结论检测外周血bcl-2/IgH MBR可作为诊断B-NHL MD辅助手段.【总页数】4页(P114-117)【作者】施纯玫;陈强【作者单位】福建省肿瘤医院,内科,福州,350014;福建省肿瘤医院,内科,福州,350014【正文语种】中文【中图分类】R733.4【相关文献】1.克隆性基因重排检测技术在淋巴瘤穿刺标本中的诊断价值 [J], 施纯玫;叶韵斌;陈强2.B细胞淋巴瘤石蜡包埋组织克隆性重链基因重排检测 [J], 施纯玫;叶韵斌;陈强3.弥漫性大B细胞淋巴瘤克隆性基因重排检测研究 [J], 陈愉;赵彤;韩西群;吴炳绪;陈美燕4.克隆性T细胞受体基因重排检测在皮肤T细胞淋巴瘤中的应用 [J], 徐晨;王琳5.石蜡包埋B细胞性恶性淋巴瘤组织克隆性免疫球蛋白重链基因重排检测研究 [J], 陈云昭;李锋;胡文浩;李新霞;李洪安;蒋金芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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基于不同方法的产品系列 -Invivoscribe 公司
基于 PCR 检测技术，简便、快 速、成本较低，所需 DNA 量少， 对DNA 质量要求不高。 灵敏度 高于 10% ，需配制胶，安全清 洁性较差。
基于PCR- 毛细管电泳检测技术， 敏感性高，检测周期较长，结 果更加直观可靠
? 鉴别诊断：明确是淋巴组织反应性还是淋巴细胞恶性增殖 ? 辅助诊断：少见类型淋巴瘤，如肝脾T细胞淋巴瘤 ? 亚类分析：明确是B淋巴恶性增殖还是T细胞恶性增殖 ? 区分同一患者两种淋巴细胞恶性肿瘤，包括复发与继发淋巴瘤 ? 微小残留病灶监测，评估治疗效果或复发风险（NGS方法） ? 细胞免疫治疗监测，监测回输T细胞增殖状况和淋巴组织来源肿瘤细胞清除效果（NGS）
IGH, TRB & TRD: V, D, and J IGK, IGL, and TRG: V and J regions
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淋巴细胞克隆性基因重排检测的临床意义
5%～15%的病例表现复杂，即使做了大量的免疫标志也可能难以鉴别其良恶性，需要进一步的手段区分。 利用分子生物学手段分析Ig和TCR基因的克隆性重排被WHO公认为该疾病诊断手段的重要补充。
22q11
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蛋白 TCRα TCRβ TCRγ TCRδ
引领精准医学
基因
TRA TRB TRG TRD
染色体定位 14q11 7q32 7p15
14q11.2
多样性与克隆性
正常淋巴细胞成熟过程 /良性病变 多克隆性
多种 形式的基因重排
恶性淋巴瘤发生的过程
单克隆性
突出 单一 形式的基因重排
淋巴细胞克隆性基因重排检测的目标分子 Ig和TCR--单一 基因重排，即恶性淋巴细胞
B-Cell Receptors (BCR) /Immunoglobulins (Ig)
T-Cell Receptor (TCR)
蛋白 Ig重链 Ig轻链? Ig轻链?
基因
染色体定位
IGH
14q32
IGK
2p12
IGL
Biomed-2研究项目（IGH为例）
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van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 17: 2257.
Biomed-2研究项目（IGH为例）
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van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 17: 2257.
分子检测 检测基因
方法
IG/TCR 基因重排
IGH，IGK， ? GEL (PAGE) IGL，TRB， ? ABI (CE) TRD，TRG ? NGS
? GEL (PAGE)
IGHV超突变
IGH
? ABI (CE)
? NGS
基因突变
EZH2, DNMT3A, IDH2…
? Sanger ? NGS
淋巴瘤基因克隆性重排和 IGHV体细胞超突变检测
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血液肿瘤（常规肿瘤）检测方案 -MICM综合分子检 测(旌准方案 )
形态学
（Morphology ）
免疫学 （Immunology）
? 免疫组化（IHC） ? 流式细胞术（FCM）
分子生物学 （Molecular）
? 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ? 毛细管凝胶电泳(CE) ? 荧光实时定量PCR(RTQT-PCR) ? 一代测序(Sanger) ? 二代测序(NGS)
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淋巴细胞克隆性基因重排检测产品特点
1
BIOMED-2 唯 一授权的商品
化试剂
2
全面涵盖各种 T\B细胞重排类
型
3
超过 400 例的临床样本 验证，反应体系稳定，
结果可靠
4
5
可疑淋巴组织增 生性疾病克隆性 分析的“金标准”
最丰富的阳性 对照
Focus On Molecular Diagnosis | Leading Precision Medicine
IGH, IGK, TRB , TRG IGHV
专注分子诊断
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从Biomed-2 到Invivoscribe- 唯一授权
Invivoscribe公司的 IdentiCloneTM系列产 品是基于PCR的克隆性检测产品，是BIOMED2唯一授权 的商品化试剂，获得 CE认证，以其 高度的灵敏性和特异性，成为可疑淋巴组织增 生性疾病克隆性分析的“金标准”。
血液
肿瘤
细胞遗传学（Cytogenetics）
? 荧光原位杂交（FISH）
辅助诊断
预后分析 指导用药 MRD检测
Focus On Molecular Diagnosis | Leading Precision Medicine
分子检测 -淋巴瘤
Moffitt, A. B. and S. S. Dave (2017). J Clin Oncol 35(9): 955-962.
结果分析
? （单）克隆性：扩增产物电泳在预期大小范围内一或双条带（峰） 送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的重排方式为单一性。表明组织中存在单克隆性增生涂抹状(smear)或阶梯状(高斯分布） 送检组织中，淋巴细胞抗原受体基因的重排方式为多样性。表明组织中不存在单克隆性增生的细胞群。
? 无扩增产物：PCR扩增后电泳未见产物 送检组织中的细胞，抗原受体基因无重排（NK，非淋巴细胞）或DNA质量过差。
marker P M H2O S1 S1 S2 S2
目前市场最被接受的检测方法。 灵敏度无法满足 MRD要求，难 以定量和得到序列。
新兴技术，更高灵敏度（ 10-6），更 高分辨率，更高的通量，更广泛的 应用。 但成本高，仪器贵，操作复 杂，时间长。
（IGH, IGK,）（IGL）（TRB ,TRD,）（ TRG）BIOMED-2方
案，唯一授权）
IGHV（依据ERIC指南）