人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定
S100A4在TGF-β1诱导的心肌纤维化中的作用研究
S100A4在TGF-β1诱导的心肌纤维化中的作用研究摘要目的：本研究旨在探讨S100A4在TGF-β1诱导的心肌纤维化中的作用及其相关机制。
方法：采用体外培养心肌成纤维细胞（CFs），添加TGF-β1进行诱导纤维化实验。
利用siRNA技术减少CFs中S100A4的表达水平，并进行相关实验分析。
使用Western blot、荧光定量PCR（qPCR）等方法检测CFs中相关蛋白及基因的表达情况。
采用免疫荧光染色法观察细胞形态变化。
结果： TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞表达S100A4，并且S100A4的表达显着升高。
采用siRNA技术减少S100A4的表达后，TGF-β1诱导的CFs的纤维化水平显著下降。
同时，siRNA靶向S100A4的表达会导致α-SMA、FN及COL1A2等心肌纤维化标志物的表达下降。
此外，TGF-β1可以促进CFs产生EMT现象，而S100A4的敲除可抑制CFs的EMT并阻止TGF-β1诱导的CFs的转移。
结论：S100A4在TGF-β1诱导的心肌纤维化中扮演着重要的作用，通过调节FN、COL1A2和α-SMA的表达实现了对心肌纤维化的调控作用。
S100A4也可以通过调节心肌细胞的EMT过程来实现其负向调控功能。
这些结果为进一步探讨心肌纤维化的机制提供了新思路。
关键词：S100A4；心肌纤维化；TGF-β1；α-SMA；FN；COL1A2；EMTIntroduction心肌纤维化是许多心脏疾病的共同特征，如高血压、冠心病、心肌梗死等。
心肌纤维化是指心肌组织中成纤维细胞（CFs）的大量积聚和胶原沉积所引起的疾病状态。
虽然一些综合治疗（如ACE抑制剂和β受体拮抗剂）和受损心肌组织的再生能力已被证实对心肌纤维化的治疗有益，但我们仍然需要更深入的理解心肌纤维化的机制以及如何更好地干预和治疗。
S100A4是一种小型钙结合蛋白，已知其在许多肿瘤中具有促进转移和生长的作用。
在最近的研究中，发现S100A4在TGF-β1诱导的心肌纤维化中也扮演重要的角色。
人心房成纤维细胞体外组织块贴壁培养与鉴定
文章 编 号 ：６ ２４ ４ （ ０ ０ ０ —０ ００ １ ７ — １ ３ ２ １ ）２ ０ ４ —３
文献标பைடு நூலகம்码： Ａ
人 房 纤 细 体 组 块 壁 养 鉴 心成 维胞 外 织 贴 培 与 定
张建 成 ， 黄 宇坚 。
（． １福建省心血 管病研 究所 内科 ，福建 福 州 ３ ００ ； ． ５ ０ １ ２福建 医科大学 省 立临床 医学院 ，福建 福州 ３０ ０ ） ５ ０ １
Ｅｓａ ｌ ｈ ｔ ｂ ｉ ｍｅ ｔｏ ｉ ｇ Ｔｉｓ ｅ Ｂｌ ｃ ｈ ｒｎ ａｌＭ ｅ ｈ ｄ Ｃｕ ｔ ｒ ｓ ｎ ｆＵｓｎ ｓｕ ｏ ｋ Ａｄ ｅ ｉ ｇ Ｗ ｌ ｔｏ ｌ ｅ ｕ Ｈｕ ｍａ ｒ ａ ｂ ｏ ｌ ｓｓｉ ｔ ｏ ａ ｄ Ｔｈ ｉ ｄ ｎ ｉｙｎ ｎ Ａｔｉ ｌＦｉ ｒ ｂ ａ ｔ ｎ Ｖｉｒ ｎ ｅ ｒＩ ｅ ｔｆ ｉ ｇ
摘 要 ： 从建立体外循环将进行心脏手术 的风 湿性 心脏病 患者体 内无菌下取心脏停跳 前右心耳组 织， 采用组 织块贴壁法进行心房成纤维细胞的分 离 培养 ， 通过光学显微镜观察培养后的细胞形态 ， 并通过免疫细胞化 学的方
法鉴定所分 离培养的细胞 。贴壁 ４ ｄ —６ 后可见长梭形贴壁生长的细胞游 离出组织块 ， 细胞 生长迅速 ，—３ ２ ｄ后即
Ｚ Ａ Ｊ ｎｃｅ ｇ，Ｈ ＮＧ ｕｊ ｎ Ｈ ＮＧ ｉ —ｈ ｎ ＵＡ Ｙ －ａ ２ ａ ｉ
（ ． ｅａｔ ｎ ｆ ａｄｏｏｙ Ｆ ｊ ｎＰｏ ｉｃ ｌ ｏｐｔ ， ｕｈ ｕＦｊ ｎ３ ０ ０ ， ｈｎ ； １ Ｄ ｐｒ ｍｅｔ Ｃ ｒｉ ｇ ， ｕｉ ｒｖ ｉ ｓｉｌＦ ｚ ｏ ｕｉ ５ ０ １Ｃ ｉａ ｏ ｌ ａ ｎ ａＨ ａ ａ
呈融合状 态， 细胞排 列紧密， 有的交叉重叠生长 ， 胞体较 大， 细胞浆透 明， 细胞核较大 ， 呈椭 圆形， 自发性搏动 。 无 免 疫细胞化学检测显示所培 养细胞波形蛋 白呈 阳性反应。通过组织块贴壁法顺利分离人心房成纤维细胞。
成纤维细胞和心肌细胞 免疫荧光
成纤维细胞和心肌细胞免疫荧光英文回答：Fibroblasts and cardiomyocytes are two different typesof cells found in the body. Fibroblasts are connectivetissue cells that play a crucial role in wound healing and tissue repair. They produce and maintain the extracellular matrix, which provides structural support to tissues and organs. On the other hand, cardiomyocytes are specialized muscle cells found in the heart. They are responsible for the contraction and relaxation of the heart, allowing it to pump blood throughout the body.Immunofluorescence is a technique used to visualize specific proteins or molecules within cells or tissues. It involves the use of antibodies that are labeled with fluorescent dyes. These antibodies bind to specific targets, allowing researchers to observe their distribution and localization within the cells. Immunofluorescence can be used to study the expression of specific proteins infibroblasts and cardiomyocytes.For example, let's say we want to study the expression of a protein called collagen in fibroblasts and cardiomyocytes. We can use immunofluorescence to label collagen using a specific antibody that recognizes this protein. By adding a fluorescent dye to the antibody, we can visualize the presence of collagen under a fluorescence microscope.In fibroblasts, we would expect to see a strong signal for collagen, as these cells are responsible for producing and maintaining the extracellular matrix, which is rich in collagen fibers. The immunofluorescence staining would show bright spots or lines, indicating the presence of collagen within the fibroblasts.In cardiomyocytes, we would also expect to see some signal for collagen, but it would be less intense compared to fibroblasts. This is because cardiomyocytes do not produce as much collagen as fibroblasts. The immunofluorescence staining would show a weaker signal forcollagen in cardiomyocytes, possibly in the form of faint spots or lines.Overall, immunofluorescence can provide valuable insights into the expression and localization of specific proteins in different cell types. It allows researchers to visualize and compare the distribution of proteins in fibroblasts and cardiomyocytes, helping to understand their roles and functions in tissue development, repair, and disease.中文回答：成纤维细胞和心肌细胞是人体中的两种不同类型的细胞。
人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定
人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定发表时间：2015-03-16T13:42:34.537Z 来源：《医药前沿》2014年第30期供稿作者：吴国盛1 吴梅芳1 蔡金明1 许春萱2 陈建泉2 [导读] 心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一。
吴国盛1 吴梅芳1 蔡金明1 许春萱2 陈建泉2 （1莆田学院附属医院心血管内科福建莆田 351100）（2福建省立医院心血管内科福建福州 350001）【摘要】目的:探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。
方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，波形蛋白(Vimentin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅷ因子(VWF) 抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。
结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。
结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。
建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。
【关键词】心肌成纤维细胞原代培养胰蛋白酶消化法差速贴壁分离法免疫荧光【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）30-0052-03 心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，而心肌成纤维细胞在这一过程中发挥着极其重要的作用。
当前，心肌成纤维细胞体外实验研究模型主要集中建立在动物的心肌，人的心肌成纤维细胞体外实验研究模型鲜有文献报道。
我们参照Neuss等学者差速贴壁分离和培养人心脏成纤维细胞的方法[1]，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法，成功分离培养出人心肌成纤维细胞，摸索出一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养方法，为人心肌纤维化研究及人心肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法，现作报道。
心肌细胞免疫荧光鉴定
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感谢支持！正文：就一般而言我们的心肌细胞免疫荧光鉴定具有以下内容：心肌细胞免疫荧光鉴定：原理、方法与应用一、引言心肌细胞免疫荧光鉴定是一种结合了免疫学、生物化学和显微镜技术的先进方法，主要用于心肌细胞中特定蛋白或抗原的定位和定量检测。
随着生物医学技术的快速发展，这一方法已广泛应用于心血管疾病的研究、诊断和药物开发等领域。
本文将详细介绍心肌细胞免疫荧光鉴定的原理、方法及其在各个领域的应用。
二、心肌细胞免疫荧光鉴定的原理心肌细胞免疫荧光鉴定的基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过荧光标记的抗体来检测和定位心肌细胞中的特定抗原。
具体来说，首先制备出针对待检测抗原的特异性抗体，并将其与荧光染料（如荧光素、荧光蛋白等）结合，形成荧光标记的抗体。
然后，将荧光标记的抗体与心肌细胞样本进行反应，使其与细胞内的特定抗原结合。
最后，通过荧光显微镜观察样本，可以直观地看到荧光标记的抗体在心肌细胞中的分布情况，从而实现对特定抗原的定位和定量检测。
三、心肌细胞免疫荧光鉴定的方法心肌细胞免疫荧光鉴定的方法主要包括以下几个步骤：心肌细胞样本的制备：通常使用细胞培养、组织切片或冰冻切片等方法制备心肌细胞样本。
样本制备过程中需要注意保持细胞的完整性和活性，以便后续的抗体结合和荧光观察。
特异性抗体的制备与荧光标记：根据待检测的抗原，制备出相应的特异性抗体，并将其与荧光染料结合，形成荧光标记的抗体。
这一步骤需要确保抗体的特异性和荧光标记的稳定性。
抗体与心肌细胞样本的反应：将荧光标记的抗体加入心肌细胞样本中，使其与细胞内的特定抗原结合。
肌卫星细胞分离培养及鉴定
肌卫星细胞分离培养及鉴定摘要：一、肌卫星细胞简介1.肌卫星细胞的功能和特点2.在肌肉组织中的分布二、肌卫星细胞分离培养方法1.常用培养方法2.实验操作流程3.注意事项三、肌卫星细胞鉴定方法1.形态学观察2.免疫荧光染色3.分子生物学方法四、肌卫星细胞在医学研究中的应用1.肌肉再生与修复2.肌肉疾病的研究3.肌肉生物学研究正文：肌卫星细胞是一种存在于肌肉组织中的干细胞，具有自我更新和分化为肌肉细胞的能力。
它们在肌肉组织中具有重要的生理功能，对于肌肉的再生与修复具有关键作用。
近年来，肌卫星细胞在医学研究中的应用日益广泛，本文将对肌卫星细胞的分离培养及鉴定方法进行介绍。
一、肌卫星细胞简介肌卫星细胞，也称为肌肉干细胞，主要分布于骨骼肌纤维周围。
它们具有自我更新和分化为肌纤维、脂肪细胞和成纤维细胞的能力，对于维持肌肉组织的稳态和再生具有重要作用。
肌卫星细胞在肌肉组织中的分布特点为：数量较少，呈散在分布；具有强的分裂能力，可以快速扩增；具有长时间自我更新的能力。
二、肌卫星细胞分离培养方法肌卫星细胞的分离培养方法有很多种，常用的方法有：胶原酶消化法、机械分离法、激光捕获显微切割法等。
其中，胶原酶消化法是最常用的方法。
实验操作流程如下：首先，取动物肌肉组织，用胶原酶进行消化；然后，用离心机将细胞分离；最后，将细胞悬液接种到培养皿中，放入含有适当生长因子的培养基中进行培养。
在实验过程中，需要注意无菌操作、合适的消化时间和温度、恰当的培养条件等因素，以保证细胞的生长和扩增。
三、肌卫星细胞鉴定方法肌卫星细胞的鉴定方法主要包括形态学观察、免疫荧光染色和分子生物学方法。
形态学观察是通过光学显微镜观察细胞的形态特征，如细胞大小、形状、染色质等。
免疫荧光染色是利用特异性抗体标记细胞表面抗原或细胞内分子，通过荧光显微镜观察细胞是否表达特定抗原。
分子生物学方法主要是通过PCR、Western blot等方法检测细胞内的基因表达或蛋白质水平。
成纤维细胞 检测方法
成纤维细胞检测方法
成纤维细胞检测方法是指用来检测和鉴定成纤维细胞的一系列实验技术和方法。
成纤维细胞是结缔组织中的主要细胞类型，参与创伤修复、纤维化等多种生理和病理过程。
因此，成纤维细胞的检测在基础研究和临床诊断中具有重要意义。
以下是一些常用的成纤维细胞检测方法的示例：
1.形态学观察：通过显微镜观察细胞形态，成纤维细胞通常呈现梭形或星形
的外观，有较长的突起。
2.免疫荧光染色：利用特定的抗体对细胞进行免疫荧光染色，可以识别和标
记特定的蛋白质或细胞标记物，如纤维结合蛋白（Fn）、胶原蛋白等。
3.流式细胞术（Flow Cytometry）：通过流式细胞仪对细胞进行多参数分析，
可以检测细胞表面的抗原、细胞内蛋白质或DNA等，用于成纤维细胞的鉴别和分型。
4.组织化学染色：利用特定的染色方法，如Masson染色、Van Gieson染色
等，可以检测细胞外基质成分和纤维化程度。
5.基因表达分析：通过检测成纤维细胞相关的基因表达谱，可以了解细胞的
生物学特征和功能状态，如PCR技术、基因芯片等。
最后概括：成纤维细胞检测方法是指用来检测和鉴定成纤维细胞的一系列实验技术和方法。
这些方法包括形态学观察、免疫荧光染色、流式细胞术、组织化学染色和基因表达分析等。
通过这些方法，可以了解成纤维细胞的生物学特征和功能状态，有助于基础研究和临床诊断。
原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
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人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定摘要】目的:探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。
方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，波形蛋白(Vimentin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅷ因子(VWF) 抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。
结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。
结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。
建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。
【关键词】心肌成纤维细胞原代培养胰蛋白酶消化法差速贴壁分离法免疫荧光【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）30-0052-03心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，而心肌成纤维细胞在这一过程中发挥着极其重要的作用。
当前，心肌成纤维细胞体外实验研究模型主要集中建立在动物的心肌，人的心肌成纤维细胞体外实验研究模型鲜有文献报道。
我们参照Neuss等学者差速贴壁分离和培养人心脏成纤维细胞的方法[1]，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法，成功分离培养出人心肌成纤维细胞，摸索出一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养方法，为人心肌纤维化研究及人心肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法，现作报道。
一、材料与方法（一）、材料:取福建省立医院建立体外循环将进行心脏手术患者心脏停跳前的右心耳组织约30mg，放入置于冰面上盛有PBS的无菌培养皿并立即送入实验室进行下一步细胞分离培养。
（二）、主要试剂及配制胰蛋白酶（美国Amersco公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone），免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠cy3（碧云天生物技术研究所），免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC（碧云天生物技术研究所），V2258小鼠波形蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司），A2547小鼠α-SMA单克隆抗体（美国Sigma公司），F3520兔VWF抗体（美国Sigma公司）。
酶消化液:将胰蛋白酶溶于ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ7.2～7.4)中，配成0.25%胰蛋白酶消化液，现配现用。
基础培养液：1包装DMEM干粉倒入约400ml膜去离子水中，磁力搅拌溶解，加膜去离子水至900ml，加NaHCO3 3.7g，青霉素和链霉素各10万U使终浓度为100U/ml，调PH值至7.2～7.4，加膜去离子水定容至1000ml，0.22um滤膜过滤除菌后分装，4℃保存。
2周内使用。
临用前，加入20%胎牛血清。
（三）、主要仪器AL104电子天平（瑞士梅特勒-托利多），3336二氧化碳培养箱（美国Forma公司），OlympusIMT221倒置相差显微镜（日本Olympus公司），OlympusBH2显微镜（日本Olympus公司），DMiRB型荧光倒置显微镜（德国Leica公司），PH211C酸度计（意大利HANNA公司）等。
（四）、方法1、取材心脏手术中建立体外循环心脏停跳前无菌条件下获取右心耳组织约30mg，放在装有无菌预冷PBS液的大EP管中，立即送实验室，置于盛预冷PBS液的培养皿中，用眼科虹膜剪剪去多余的外膜和脂肪，预冷PBS液清洗3次，去除血污，把心耳组织剪1mm×1mm×1mm的组织块备用。
2、酶消化分离培养法组织碎块移入加有搅拌子的锥形瓶中，酶消化液冲洗剪刀及培养皿，转移至锥形瓶中。
加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍，37℃水浴箱孵育，打开磁力搅拌器，60r/min搅拌10min，吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞，自然沉降2min后遗弃上清液。
再次加入酶消化液10～15ml消化10min。
吸取上清液入离心管，加入预冷培养液2ml，吹打均匀后，1200r/min离心4min，弃上清，细胞沉淀加预冷的培养液吹打后用封口膜封口放于冰中备用。
剩余组织块重复上述过程若干次，直到组织块消失，分次收获细胞。
3、细胞培养将分次收获的细胞悬液集中离心1次，将所有细胞沉淀集中于一个离心管加适量培养液再离心1次。
弃上清液加10ｍｌ含20%胎牛血清的DMEM培养液中，吹打几次以散开所有的细胞团接种于培养瓶中，置体积分数5%CO2、95%空气、37℃培养箱中培养，放置1ｈ差速贴壁，最先贴壁为心肌成纤维细胞，弃含有心肌细胞的未贴壁的细胞悬液，加10ml含20%胎牛血清的DMEM培养液中，继续培养心肌成纤维细胞，每2天换液1次。
4、分离纯化心肌成纤维细胞在细胞培养中，心肌成纤维细胞具有分裂增殖能力，且生长迅速，贴壁较早，根据心肌成纤维细胞较心肌细胞贴壁速度较快的原理做差速分离去除心肌细胞。
贴壁细胞基本为成纤维细胞.每天在显微镜下观察细胞，并及时更换细胞培养液。
原代培养3～5天左右，见细胞形态由长梭形逐渐变成圆形或长满瓶壁的80%以上即可进行传代培养。
小心吸去瓶中原培养液，注意避免晃动及刮擦，加入2mlPBS清洗后（刚好浸没瓶壁），用1～2ml含0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化约1～2min，倒置显微镜下观察细胞收缩变圆后立即将消化液吸出，并加入2ml含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞并制成细胞悬液，将所得细胞悬液按体积比1:2稀释后接种于新培养瓶进行传代，实验用第2～3代细胞。
5、细胞活力检测用体积分数4%的台盼兰染液进行活细胞拒染，加入细胞计数板中，立即置于100倍镜下，进行细胞活力检测，未被台盼兰染上蓝色的为活细胞。
细胞成活率(%)=[(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%][2]。
6、形态学观察倒置光学显微镜观察:在倒置光学显微镜下观察培养液色泽变化;观察心肌成纤维细胞生长状态、形态变化。
7、心肌成纤维细胞的免疫荧光染色鉴定（1）、心肌成纤维细胞的Vimentin抗原鉴定取传2代心肌成纤维细胞以105个细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板，1-2天后用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入1ml固定液（4%多聚甲醛），固定30min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入封闭液1ml，在摇床上轻轻摇动封闭60min，滴加1：200稀释1ml小鼠波形蛋白抗体，室温孵育120min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；然后滴加1:1000稀释1ml荧光标记的抗小鼠Cy3结合小鼠波形蛋白，室温避光孵育60min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min；最后把抗荧光淬灭封片液滴于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜下观察。
（2）、心肌成纤维细胞的α-SMA抗原鉴定取传2代心肌成纤维细胞以105个细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板，1-2天后用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入1ml固定液（4%多聚甲醛），固定30min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入封闭液1ml，在摇床上轻轻摇动封闭60min，滴加1：400稀释1ml小鼠α-SMA抗体，室温孵育120min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；然后滴加1:1000稀释1ml荧光标记的抗小鼠Cy3结合小鼠波形蛋白，室温避光孵育60min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min；最后把抗荧光淬灭封片液滴于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜下观察。
（3）、心肌成纤维细胞的VWF抗原鉴定取传2代心肌成纤维细胞以105个细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板，1-2天后用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入1ml固定液（4%多聚甲醛），固定30min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入封闭液1ml，在摇床上轻轻摇动封闭60min，滴加1：800稀释1ml兔VWF抗体，室温孵育120min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；然后滴加1:1000稀释1ml荧光标记的抗兔FITC结合兔VWF抗体，室温避光孵育60min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min；最后把抗荧光淬灭封片液滴于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜下观察。
二、结果（一）、台盼蓝排斥实验结果：经台盼兰染液进行活细胞拒染，测得细胞活力均在90%-95%。
（二）、细胞形态学观察普通光学显微镜观察差速贴壁法最先贴壁的为心肌成纤维细胞，细胞呈不规则形或椭圆形，后变为长梭形，胞体平坦，体积较大，细胞核较大，椭圆形，经常含有2-3个核，培养过程中不发生自发性搏动(见照片1、2)。
（三）、心肌成纤维细胞纯度鉴定细胞免疫荧光染色结果：可见细胞浆波形蛋白抗体、α-SMA抗体染色呈阳性，纯度大于95%（见照片3、4）。
VWF抗体染色阴性。
证实为人心肌成纤维细胞。
附图三、讨论体外细胞培养模型对于心肌成纤维细胞与心肌纤维化研究实验的开展有着十分重要的作用，而本实验建立的人的心肌成纤维细胞培养模型，其结果比在动物模型上的研究更加可靠。
目前心肌成纤维细胞的培养方法繁多，主要有胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶+胶原酶消化法、组织块法等。
组织块培养法培养人心肌成纤维细胞虽然操作简便，细胞同源性好，纯度高，但部分组织块生长能力较差，培养的成活率较低，到可传代的时间较长，污染和感染的机会增加。
而酶消化法是一种较为快捷的原代培养方法，利用消化酶将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等消化去除，使细胞分散，形成悬液，可以很快得到大量活细胞，细胞也可在短时间内贴壁生长成片。
酶消化法常用有胶原酶+胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶消化法，由于心肌成纤维细胞其活力强，对环境要求偏低，故两种酶消化方法得到的原代心肌成纤维细胞从外形和纯度上都没有明显区别，而采用胶原酶+胰蛋白酶消化法时其中的胶原酶主要是对细胞间质的胶原纤维进行消化，在这一过程中，胶原蛋白酶消化心肌组织时也会对心肌成纤维细胞产生一定程度的影响［3］。
本实验参照Gustafsson［4］的胰蛋白酶消化法及Neuss等［1］研究的差速贴壁分离培养方法，经过相关消化条件的改良，如原代培养时，只用浓度0.25%的胰蛋白酶，从某种程度上避免了胶原蛋白酶对心肌成纤维细胞的潜在损害，从而更好地保存了其自身增殖能力的特点；采取分时段分次收集细胞，避免活细胞长时间持续的接触消化酶，增加培养液胎牛血清浓度，由常用的10%增加为20%，这样既保证把组织块充分分离成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢物，又减少消化酶对细胞的化学损伤。