纳米材料转运siRNA在肿瘤治疗中的研究进展

纳米材料转运siRNA在肿瘤治疗中的研究进展摘要RNA干扰及其作用机制被发现以来，外源性的小干扰RNA(siRNA)已广泛地用于从基础研究到临床实践的很多领域。

然而，如何有效地、特异地将siRNA转运至靶细胞始终是使用者关注的重点，并已逐步成为siRNA应用于临床治疗的瓶颈问题之一。

虽然基于病毒载体的RNA 干扰既具有靶向性也显示出高转染效率，但病毒可能引起突变或者免疫原性等问题。

纳米材料是典型的非病毒载体，尺寸小、易修饰，而且能够有效携带siRNA进入细胞并诱导RNA干扰。

近年来，人们利用siRNA研究癌基因的功能，在癌症治疗方面取得了重大进展。

本文回顾了纳米材料转运siRNA在癌症治疗领域相关研究。

关键词：纳米材料，siRNA，siRNA转运，RNA干扰1998年Fire等人发现在秀丽隐杆线虫中进行反义RNA抑制实验时，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出更强地特异性阻断相应基因表达的效果，并且将这种现象命名为RNA干扰[1]。

2001年，Elbashir等将人工合成的21个核苷酸的双链RNA导入到哺乳细胞中，同样发现了这种序列特异性地阻断基因表达的RNA干扰现象[2]。

自从RNAi发现以来，制药公司对siRNA药物的研发热情空前高涨，siRNA 药物在基因疾病、艾滋病、肿瘤等人类目前束手无策的疾病上显现出极大的应用潜力。

短短十几年，人们已经利用siRNA 作为药物治疗多种疾病。

本文总结了最近纳米材料转运siRNA在癌症治疗领域的相关研究。

首先，简单介绍了siRNA的作用机制及其在癌症治疗方法的发展；然后，介绍了无机及有机纳米材料转运siRNA的研究工作；接下来，介绍了纳米材料转运siRNA在临床治疗中的应用；最后，对纳米材料转运siRNA在癌症治疗领域应用的挑战和前景进行了展望。

siRNA作用机制及其癌症治疗潜力长的双链RNA被Dicer酶剪切成21-23个核苷酸组成的双链RNA 或者直接导入人工合成的siRNA后，与细胞质中的若干个蛋白组成的沉默复合体(RNA.induced silencing complex，RISC) 结合，并且RISC中的Argonaute 2蛋白将siRNA解旋成单链，其正义链被剪切下来并在细胞质中被降解掉。

此时，只结合反义链的RISC被活化，活化型RISC 复合体受反义链引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并切断靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解，这个活化RISC复合体继续序列特异性地结合在其它的mRNA上并切断mRNA，从而导致基因沉默现象。

由于siRNA能够简单高效地沉默靶基因的表达，因此成为研究基因功能的重要工具。

而且siRNA作为药物选择性会更好，能够特异性下调致病基因的表达，并不影响细胞中正常基因表达;而且，通过合理的siRNA设计，理论上能够沉默体内的任何基因，这与传统的小分子药物相比更具有治疗潜力。

RNA干扰技术可通过调控周期素依赖性蛋白激酶（CDKs）、胰岛素生长因子（IGF）、血管内皮生长因子（VEGF）及抗细胞凋亡等因子的表达而控制靶标癌细胞无限扩增的行为，从而抑制癌症的发展。

细胞周期素和CDKs严格调控细胞的周期，因此周期素过表达会打破细胞周期而利于癌症的发展。

细胞循环素B1与肾癌、前列腺癌及胸腺癌等有关，通过siRNA抑制活体内循环素B1的表达可以抑制前列腺癌和肺癌。

基于此，利用siRNA治疗癌症的策略就是一个通过限制或阻止癌细胞内靶标蛋白的表达而令癌细胞功能缺失的过程。

2002年，Sharp等研究者在细胞实验中证明siRNA能够有效抑制艾滋病感染[3]。

2003年，宋尔卫等研究者在动物模型上证明通过siRNA 下调细胞凋亡受体Fas基因的表达能够避免致命性的肝损伤，提高了小鼠的存活率，首次在动物疾病模型中展示了siRNA疗法的巨大潜力[4]。

其后，siRNA疗法被广泛地应用于多种动物模型，研究其对各种疾病的治疗价值。

2004年，Acuity Pharmaceuticals公司推出首例针对老年性黄斑病变的siRNA药物Cand5的临床实验。

Alnylam公司经鼻腔给药的siRNA 药物ALN-RSV01能够有效对抗小鼠呼吸道合胞病毒，ALN-RSV01是首个进入临床试验的抗病毒siRNA药物。

其I期临床试验显示了较好的安全性和耐受性。

该siRNA药物于2008年进入II期临床试验[5]。

2008年5月，Calando Pharmaceuticals公司申请的治疗实体肿瘤的siRNA 药物CALAA-01被美国FDA批准启动I期临床试验，这是siRNA干扰药物治疗癌症的首例临床试验。

RNA干扰治疗的另一大优点是整个治疗过程不会与DNA发生相互作用，因此不会对基因组进行永久性修饰。

而且siRNA治疗可以随时终止或被调控，是一个严格的调控因子也经得起生物安全性的考量。

目前，siRNA的体内基因沉默效率受限于其转运途径，因此发展siRNA特异的有效的转运方法是临床应用的必要前提。

随着siRNA稳定性的提高和体内siRNA给药手段的建立，大量的研究者发现利用纳米载体输送siRNA沉默高表达的原癌基因能够有效抑制肿瘤的生长。

纳米材料转运siRNA未作修饰的siRNA受自身理化性质的影响在临床应用中受限，其较大的分子质量及表面携带阴离子的自然性质致使其不能被细胞有效摄取。

由于血液中存在核酸酶，直接注射siRNA容易被降解。

然而，利用纳米颗粒包裹siRNA可以有效的保护siRNA、降低免疫刺激以及介导细胞内吞，成功实现siRNA的转运。

有机纳米颗粒典型的有机纳米颗粒是由可以自组装成较大聚集体的聚合物或表面活性剂组成。

这些材料的覆盖面很广，从人工合成的可降解或不可降解的聚合物到蛋白质等天然的材料。

脂质体及树枝状大分子等聚合物纳米颗粒是典型的有机纳米颗粒。

常用的环糊精-聚合物治疗体系虽然不属于严格意义上的纳米颗粒，但也是有效的药物转运载体。

脂质体是由有机脂质有规则的排列形成的水滴状的双层脂质结构。

中性脂质体较较阳离子脂质体有较好的生物相容性和较低的细胞毒性，但是其与携带阴离子的聚核苷酸的相互作用较弱，不利于有效包裹siRNA。

为了能兼顾两方面的优势，携带两性离子的DOPC被用作siRNA转运载体。

通过DEPC包裹的siRNA靶向卵巢癌蛋白EphA2，极大的减缓了癌症的进程[6]。

近年来，基于脂质的纳米转运系统与其他材料结合，显示出了更大的优势。

核酸与脂质组成的核酸脂纳米颗粒（SNALPs）十分稳定，且具有较好的基因转运能力。

Judge等通过SNALPs包裹siRNA靶向细胞循环蛋白PLK1和KSP，在肝脏和皮下肿瘤模型中实现了抗肿瘤效果[7]。

2010年12月，加拿大Tekmira药物公司启动了SNALPs包裹siRNA靶向PLK1蛋白药物的临床I期研究。

聚合物纳米颗粒是生物可降解的胶状固体，在药物和基因转运研究中得到了广泛的应用。

聚合物纳米颗粒包括环糊精、壳聚糖等合成聚合物纳米颗粒及PEI、PLGA和树枝状大分子等天然聚合物纳米颗粒。

环糊精细菌降解纤维素过程中形成的天然聚合物，可以与小分子等形成水溶性较好的复合物。

Lieskoven等开发了转运siRNA的环糊精聚合阳离子系统，该系统由环糊精聚合物、PEG及人类转铁蛋白组成，通过转铁蛋白靶向癌细胞表面过表达的转铁蛋白受体来靶向癌细胞[8]。

该靶向转运系统被称为CALL-01，由美国Calando药物公司启动其临床I期研究，是第一个siRNA临床I期药物。

CALLA-01中的siRNA通过抑制和核糖核苷酸还原酶M2亚基的表达来抑制肿瘤。

壳聚糖是一种天然的多糖，已经被广泛用于转运质粒DNA和siRNA。

壳聚糖的优势是粘膜附着性、生物相容性、生物可降解及低成本。

然而，壳聚糖转运相关研究之间存在结果的不一致，而且高分子质量的壳聚糖存在一定的细胞毒性，同时壳聚糖通过内吞进入细胞，逃脱溶媒体也是一大挑战，这些严重限制了壳聚糖纳米颗粒在临床研究中的应用。

PEI是常见的高效阳离子聚合物转运载体，在siRNA转运凌云得到了广泛的应用研究。

PEI与携带负电荷的siRNA通过简单短暂的h聚合过程自发的形成多聚物，防止siRNA被核酸酶降解的同时降低siRNA对细胞的免疫刺激。

然而，PEI复合物可以破坏细胞膜，引发细胞凋亡，有显著的细胞毒性，这极大的限制了临床应用。

PLGA是果酸和乳酸的共聚物，是FDA批准的生物可降解的质粒DNA和siRNA纳米转运共聚物。

基于PLGA的siRNA转运具有高稳定性、易被细胞内吞、易通过吸附或连接的方式靶向特定的组织或器官、生物可降解、低毒及稳定释放等特性。

但是，单纯的PLGA与siRNA之间的静电相互作用很弱，不利于装载siRNA[9]。

为了克服这一劣势，需要在PLGA表面修饰PEI等阳离子聚合物。

树枝状大分子是合成的树枝状单分散的高度对称的三维球形纳米颗粒，其特殊的形状和尺寸性质使其具有作为药物载体的潜在能力。

Arima等用叶酸α-CDE 进行不同程度的修饰，制备了HA-PEG-α-CDEs复合物，用它负载siRNA靶向叶酸受体过表达的癌细胞，发现该复合物通过内吞作用进入细胞内，转染效率得到提高。

通过静脉注射和瘤内注射，复合物会在肿瘤组织部位富集，并且不产生干扰素和炎症反应[10]。

无机纳米颗粒大量的无机纳米颗粒被用于转运siRNA实现成像或治疗等应用，这些无机纳米颗粒包括磷酸钙和碳酸钙等无机盐、石墨烯和碳纳米管等碳纳米材料及纳米金等金属纳米颗粒。

磷酸钙(CaP) 是骨骼、牙齿中的主要成分之一，具有优异的生物相容性和生物降解性，以CaP作为siRNA的转运载体，可保护细胞膜结构完整性，并且CaP在胞内可迅速降解，不产生细胞毒性和免疫原性。

但是，磷酸钙纳米颗粒自身的表面正电位低，对siRNA的负载量小，沉默效率低。

对磷酸钙纳米颗粒进行表面阳离子修饰，增大siRNA负载量，提升siRNA转染效率是众多研究的重点，如Klesing等制备了一种功能磷酸钙—羟基磷灰石纳米棒，用PEI进行表面阳离子修饰，提高了siRNA负载量，显著提升转染效率，且对细胞无毒性作用。

Kakizawa等通过自关联组装合成聚乙二醇-聚天冬氨酸-磷酸钙，它具有优异的胶体稳定性，对siRNA的包封率高达100%，在胞内的降解速度缓慢，可有效完成siRNA缓释[11]。

Zhang等在CaP合成反应体系中加入Mg2+，钙离子和镁离子的交换使原子结构扭曲，减缓颗粒的生长速度，可提高siRNA-CaP的转染和沉默效率[12]。

Stat3对肿瘤的生长不可或缺，Liang等用CaCl2 修饰的HAP携带si-Stat3注射到小鼠肿瘤中，发现Stat3表达量和肿瘤的生长明显受到抑制[13]。