实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定

实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定

一、实验目的：通过本实验的学习，掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定技术，掌握高速冷冻离心机、可见分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等仪器的使用。

二、基本原理：

鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。

鸡卵类粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不均一性。目前至少已获得四种不同的组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖部分（主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上则有差别。它们的等电点有一定的范围，大致在pH3.9~4.5。相对分子量28，000。卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶克分子比为1：1，因此高纯度的卵类粘蛋白1微克能抑制相当于0.86微克的胰蛋白酶（比活力为12，000BAEE单位/毫克蛋白）。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差异，鸡卵类粘蛋白N—末端基为丙氨酸（C—末端为苯丙氨酸）。

卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。

本实验主要参照Kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，在经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品。

三、试剂与器材

3.1粗提所需试剂：

丙酮，0.5M三氯乙酸，0.2M pH6.5磷酸盐缓冲液；

3.2 纯化所需试剂：

0.02M pH6.5磷酸缓冲液，；DEAE-纤维素32或52，0.5M氯化钠-0.5M氢氧化钠溶液，0.5M盐酸，0.02M，pH6.5磷酸盐缓冲液,0.30M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，1.0 M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，聚乙二醇8000，蔗糖。

3.3 胰蛋白酶活力及粘蛋白抑制活力测定试剂：

0.05M pH8.0Tris-HCl缓冲液，BAEE-0.05M,pH8.0 Tris-HCl缓冲液（每毫升Tris-HCl缓冲液含0.34毫克BAEE和2.22毫克氯化钙），结晶胰蛋白酶溶液

（0.4mg/mL, 0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液配制），0.4M Na

2CO

3

（无水碳酸钠42.4g，

无离子水定溶至1000ml），0.4M三氯乙酸（三氯乙酸65.4g，无离子水定溶至

1000ml），2%酪蛋白溶液（干酪素5g，用少量0.1M NaOH加热溶解后，0.1M pH6.5磷酸盐缓冲液定溶至250ml），100ug/ml酪氨酸溶液（105℃烘干2小时的酪氨酸0.1g，用少量0.1M HCl溶解后，无离子水定溶至100ml，即1000ug/ml,取10ml，无离子水稀释至100ml即成100ug/ml）, Folin乙试剂。

3.4器材

新鲜鸡蛋、透析袋、层析柱（1.0*20cm）、贮液瓶（柱层洗洗脱用）、试管及试管架、广泛试纸、擦镜纸、滤纸（7cm）、移液管（0.5mL，1mL）、冰箱、计时器、恒温水浴锅、紫外分光光度计、可见分光光度计、部分收集器、紫外检测仪（包括记录装置）、高速冷冻离心机、电磁炉、磁力搅拌器。

四、操作步骤：

（一）粗品的制备：由1枚新鲜鸡蛋大约获得25-30mL蛋清，盛于250mL烧杯内，放置于温水浴锅内使温度达到25-30℃，在不断搅拌下，缓慢加入等体积4℃预冷的三氯乙酸—丙酮溶液（0.5M TCA与丙酮的体积比为1：2V/V），立即出现大量白色沉淀，加完后最终pH应为3.5，如高于pH 3.5，用0.5M TCA调到pH 3.5,再继续搅拌30 min，然后在4℃下放置1-2 h,离心(4000 rpm,20 min)，约得25-30毫升黄绿色清液。

边搅拌边加入2倍于上清液体积的4℃预冷的丙酮，可见白色沉淀产生，在冰箱中放置1-2 h，离心(4000 rpm,20 min)，弃上清液，得沉淀，加入2ml无离子水，溶解沉淀，装入透析袋对水透析以除去残留的TCA，透析过程中有少量沉淀出现，将透析袋中的溶液离心(4000 rpm,20 min)，弃沉淀，将上清液倒入25mL量筒中，加入1/10上清液体积的0.2 M pH6.5磷酸盐缓冲液，摇匀，测量并记录粗品总体积，可供下步上柱纯化之用。

（二）纯化：

2.1 DEAE-纤维素的处理及再生：

新纤维素的处理：取50克DEAE-纤维素-32或DE-52（Whatmah进口分装），用少量水溶胀1 h，用0.5M氯化钠溶液—0.5M氢氧化钠溶液（即1M氯化钠溶液与1M氢氧化钠溶液等体积混合，搅拌处理20分钟、用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M盐酸与0.5M氯化钠溶液搅拌处理20分钟、用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5M氯化钠溶液—0.5M氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。

旧纤维素的再生：省去酸处理一步，只用0.5M氯化钠溶液—0.5M氢氧化钠溶液处理一次，用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。

2.2 装柱：

层析柱垂直安装在铁架台上，夹紧柱下端的硅胶管。先加入1/3-1/2柱体积的水，取一合适大小的玻璃漏斗，安装在柱的上端（使漏斗颈的外径与层析柱的

内径吻合，不能使层析柱中的水或缓冲液渗出）。将处理好的DEAE-纤维素连同一些水倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度，打开柱下端的硅胶管，继续搅拌、沉降至3/4柱高。将柱下短的硅胶管连接在核酸蛋白监测仪样品池的入口。打开核酸蛋白监测仪电源，预热至少30min。

2.3平衡：打开蠕动泵，用0.02 M pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡层析柱，最少用3倍柱体积的0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液平衡，平衡过程中，调节蠕动泵的流速，记录柱下端流出速度，使之在1-2ml/min之间。始终保持柱床上边最少有2cm 高度的缓冲液，注意不能干柱，否则需重新装柱。

平衡过程中，调试核酸蛋白监测仪。首先将旋钮拨到T100%(指透光率)，调“光量”到显示100，再将旋钮拨到 A（吸光度）（A有不同灵敏度，一般选择0.5A），调节“调零”到显示0。继续平衡，如数字有波动，反复调节几次，使A 值保持示为0。

2.4 上样及洗脱：

关掉蠕动泵，打开柱上端的螺扣，将柱床上边的缓冲液吸出，然后立即贴壁加1ml样品（粗提样品），使样品全部缓慢流入层析柱床内，立即加0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液到柱床上边保持2cm高度。拧好柱上端的螺扣，打开蠕动泵，继续以相同的磷酸盐缓冲液进行平衡，观察核酸蛋白监测仪的A值变化情况。当A 值急剧上升时，计时，同时以试管收集对应的流出液（核酸蛋白监测仪的样品池出口），每收集2ml，换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下降到数值稳定时，可停止收集流出液，这部分流出液主要为溶菌酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂等杂蛋白。然后改用0.3M氯化钠-0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，同样，当A值急剧上升时开始收集，计时，以试管收集对应的流出液（核酸蛋白监测仪的样品池出口），每收集2ml，换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下降到数值稳定时，可停止收集流出液，这部分流出液多为具有抑制胰蛋白酶活性的的卵类粘蛋白，即部分纯化的卵类粘蛋白，纯度相当于一般商品，即1毫克蛋白的产品能抑制近1毫克的胰蛋白酶，比活力为10，000 BAEE单位/毫克蛋白，并含有少量抑制胰凝乳蛋白酶的抑制剂（Chymotrypsin inhibitor）每毫克产品能抑制a-胰凝乳蛋白酶的量小于0.03毫克。

收集的部分纯化的卵类粘蛋白可直接用于活性和蛋白质浓度测定，一般情况下，由于实验课时限制，洗脱流速较快，导致洗脱体积过大，需要蔗糖浓缩到2-3ml左右，再对水透析，最大体积不要超过5ml，活力测定前，要对0.1mol/L pH8.0 PB缓冲液透析，透析后测量体积，为纯化后类粘蛋白的总体积。

（三）酶活力测定：

3.1 BAEE法

L-arginine ethyl ejtev简称BAEE）为底物，用紫外吸收法测定。方法如下：