蛋白质分离纯化实验论文样板

胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究

摘要

胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究，包括胰蛋白酶亲和配基CHOM的制备，胰蛋白酶的亲和层析分离纯化，凝胶电泳鉴定及分子量测定，胰蛋白酶的动力学研究等。分离纯化蛋白质是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。根据蛋白质的不同性质，分离纯化的方法也是不同的。

关键词：分离定量亲和层析凝胶电泳动力学研究

目录

摘要.............................................. I

1、蛋卵粘蛋白的分离与定量 (1)

1.1蛋白质沉淀法 (1)

1.2高速离心法 (1)

1.3蛋白质脱盐 (1)

1.4蛋白质定量 (2)

1.5蛋白质标准曲线制作及CHOM浓度测定 (2)

2、亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 (3)

2.1亲和层析法 (3)

2.1.1亲和层析法的介绍 (3)

2.1.2亲和层析法的各项要素 (3)

2.2胰蛋白酶活性测定 (3)

2.2.1酶活力的测定 (3)

2.2.2胰蛋白酶活力测定 (3)

2.2.3N-苯甲酰-L-精氨酸乙脂（BAEE）法 (4)

2.2.4酪蛋白法 (4)

3、胰蛋白酶的凝胶电泳鉴定 (5)

3.1蛋白电泳槽的组装 (5)

3.2凝胶的选择和制备 (5)

3.3样品的处理 (6)

3.4电泳 (6)

3.5染色与脱色 (6)

3.6实验结果及处理 (7)

4、胰蛋白酶动力学研究 (8)

4.1胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数 Km 及最大速率 V 的测定 8 4.1.1绘制时间-光吸收关系曲线法 (8)

4.2终止法测定胰蛋白酶的Km、最大速率 V 及胰蛋白酶抑制剂的

动力学研究 (8)

5、总结........................... 错误！未定义书签。

参考文献.......................... 错误！未定义书签。谢辞 (13)

1 蛋卵粘蛋白的分离与定量

材料：新鲜鸡蛋，透析袋

操作：

1.1蛋白质沉淀法

在各种分离方法中，沉淀法是常用在前面的几个步骤，尤其很多方便的沉淀方法，可以有效地将蛋白质从粗提液中分离出来。

①硫酸铵沉淀法：每个蛋白质溶液分子表面上，都分布有若干比例的非极性区域，会凝集许多水分子以便溶入水溶液中；若在此水溶液加入大量硫酸铵，则因为硫酸铵的高度水合能力，抢走聚集在蛋白质表面的水分子，使得蛋白质表面的非极性区域暴露出来，相互以疏水性引力结合，并成为聚合体而沉淀下来。

②等电点沉淀法：若把蛋白质溶液的PH调到其等电点，则此蛋白质所带的净电荷为零，分子间的排斥力因而下降，得以相互吸引成聚合体而沉淀。

③溶剂沉淀法：当蛋白质水溶液加入大量有机溶剂，水分子浓度被稀释，蛋白质的溶解度便迅速下降，而沉淀下来。但有机溶剂有丙酮或甲醇，在沉淀后也常用乙醚来带走丙酮，以加速干燥。

另外，三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)是很强的蛋白质变形剂，许多蛋白质遇到TCA都会变性沉淀，无法再恢复原态。TCA对皮肤有很强的腐蚀性，不小心接触后要马上冲水，通常TCA并不被用在纯化蛋白质的步骤中，而是用来沉淀或移除大部分非目的蛋白质。

1.2高速离心法

离心是分离固态与液体最方便的方法，因此蛋白质以上述方法沉淀下来后，接着便可用高速离心法，把形成固态或半固态的带白纸分离出来。这样的离心都要在低温下进行，以免离心时产生高温，导致目的蛋白变性。在实验室中，高速离心机是较危险的仪器，一定要注意离心管是否正确平衡，离心转速是否设定正确。第一次操作任何离心机时，一定要有熟练的人员在旁监督，以免发生危险。

1.3蛋白质脱盐

脱盐是一种重要的生化操作，可以把小分子与巨分子分离开来，是生化实验常用的步骤，通常脱盐效果的好坏，对下一步实验有决定性的影响。有下面几种方法可以使用：

①析袋：是最常用的方法，透析袋有各种大小不同的网目，可以分离分子量不同的大小分子。透析袋一般在使用前需经前处理。

②体过滤法：可以依照分子量大小不同来进行分离，利用胶体小球内的孔道，使小分子进入而被延滞在胶球内，大分子则得以迅速流出，因而出了盐类，达到脱盐的效果。

③微薄膜过滤：超微薄膜是一层具有极小孔径的薄膜，可以区别分子的大小，小分子如盐类可以通过微孔，大分子则被保留，因而去除盐类；通常使用超微薄膜过滤都需要加压，以增加小分子通过的速率。

1.4蛋白质定量

蛋白质定量是最基本的生化操作，方法很多，但其原理都还是基于蛋白质分子的基本构造。早先使用Biuret method，是根据蛋白质骨架与铜离子结合，利用所产生的还原力显色；而Lowry method是以Biure method为基础，再加上蛋白质中Try侧基的显色，使得分析更为灵敏。最近则使用燃料Coomassie Brilliant G-250(CBG);当蛋白质与CBG结合之后，CBG由茶色变成蓝色，显色浓淡与蛋白质质量成正比，称为Bradford method。

以Bradford法定量蛋白质

Bradford dye-biding method是利用Coomassic Brilliant Blue G-250(CBG)可与蛋白质结合而变色的特性来定量；若样品中蛋白质质量较多，则结合到蛋白质而表色的CBG也多，因而显色较深。本实验就是以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质与光吸收值的标准曲线，然后求得所测样品的蛋白质含量。

1.5蛋白质标准曲线制作及CHOM浓度测定

图1 蛋白质含量标准曲线

2 胰蛋白酶的亲和层析分离

材料：鸡卵类粘蛋白，CHOM溶液，猪胰脏

操作：

2.1亲和层析法

2.1.1亲和层析法的介绍

若A与B两分子之间，有专一性的亲和力，而我们手中已有A；若欲从样品混合物中，将所含的B分子分离出来，则最简便的方法，是先将A固定在一固定相（solid phase）上，当样品混合物通过此固定相时，其中的B分子即被A吸附到固定相。在洗去混合物中其他杂质后，破坏A-B之间的吸引力，溶离下B，即可得到纯质B。亲和层析法是很有效的纯化方法，但并非任何物质均可应用此法，因为不一定能找到对它有亲和力的分子。因此，进行亲和层析法的第一条件为，寻找分子之间具有亲和力的配对：

A+B=AB

而其理解常数，Kd=[A][B]/[AB]约在10^-4至10^-8；亲和力大小须适中。

可以用图X4-1说明亲和层析法的进行步骤：

1)分子A已经被结合到固相载体上（斜线部分），样品准备从上方流下，其中含

有所要分离的B分子以及非专一性分子杂质。

2)当样品通过此亲和吸附剂时，只有B被吸附，其余杂质将直接流出。

3)破坏AB分子间的亲和力，即可获得纯质B。

2.1.2亲和层析法的各项要素

要成功建立一个良好的亲和层析法，必须考虑几个重要因素

1）Ligand及其专一性结合分子

2）良好的固相载体

3）Ligand与固相载体的偶联反应

4）可溶离下所要分离的目标分子

2.2胰蛋白酶活性测定

2.2.1酶活力的测定

在酶的分离纯化过程中，都要随时测定酶活性，计算酶的比活性，用以确定分离过程中各步骤的效能、决定粗酶的取舍以及酶储存期间质量的变化，所以酶活性的测定是酶学研究中最常用的实验方法。

2.2.2胰蛋白酶活力测定

在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N-端得赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。

2.2.3N-苯甲酰-L-精氨酸乙脂（BAEE ）法 2.2.4酪蛋白法

胰蛋白酶活力和比活力的测定

图二 亲和层析洗脱曲线

图三 时间-光吸收关系曲线

胰蛋白酶溶液的活力单位(BAEE 单位/mL)= 酶液加入体积稀释倍数

???001.0253A =11050 胰蛋白酶比活力(BAEE 单位/mL)= 酶液加入体积胰酶浓度酶液活力

?=203125

3 胰蛋白酶的凝胶电泳鉴定

材料：CHOM，胰脏提取液（PX，粗酶），trypsin.

操作：

3.1蛋白电泳槽的组装

将垂直平板电泳槽装好

①实验前后，必需使用干净纱布和少量洗手液清洗玻璃板，然后用清水冲洗干净，洗干净的玻璃板从水盘中轻轻拉出，应不挂水滴，否则请重洗。

②制胶底座橡胶的保护膜请勿丢失，实验结束后应将保护膜重新盖好橡胶。

③主体与制胶底座装配完毕后，应用水先试漏；试漏后可用滤纸将水吸干或倒出。

④主体与制胶底座装配完毕后，如需移动时，应将力作用在制胶底座，在桌面水平推移，禁止直接提起主体，以防漏液。

3.2 凝胶的选择和制备

a) 按照蛋白质不同的相对分子量选用不同浓度的分离胶，

b) 分离胶的灌制

根据待测蛋白质样品的相对分子量选择合适的分离胶浓度，本实验胰蛋白酶的分子量约为

23,400，采用 12%的分离胶，配制 10 mL。

在 50 mL 烧杯中根据配方表按顺序依次加入试剂，由于加入过硫酸铵（AP）后凝胶就开始聚合，所以应立即摇晃烧杯小心混合均匀，并避免气泡产生，然后用注射器吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加 1 cm的空间以便灌注浓缩胶，用注射器小心地在溶液上覆盖一层纯水，以压平凝胶液面。将电泳槽垂直静置于室温下约20～30 min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的纯水，尽可能去干净。

灌胶高度示意图

c) 浓缩胶的配制和灌制

一般采用5%的浓缩胶，在50 mL 烧杯中根据配方表配制 5 mL，按顺序依次加入试剂，由于加入过硫酸铵（AP）后凝胶就开始聚合，所以应立即摇晃烧杯小心混合均匀，并避免气泡产生，然后用注射器灌注在分离胶上，操作参考分离

胶的灌注。直至液面离玻璃板顶端约0.2 cm，小心插入梳齿，避免混入气泡，置于室温下至浓缩胶完全聚合（约20 min）。

3.3样品的处理

a)标准蛋白样品的制备[Protein Molecular Weight Marker (Low)]：取出一管

预先分装好的 8 μL 低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热 3-5 min，取出冷至室温。

b)待测样品的制备：

3.4 电泳

a) 待浓缩胶完全聚合后，将主体从制胶底座卸下，放入电泳槽下槽，往内槽加缓冲液至玻璃凹口以上，外槽缓冲液加至距平玻璃上沿 5 mm 处（注意避免在胶室下端出现气泡）；小心拔出梳齿。然后用注射器吸取电泳缓冲液吹洗加样孔（梳孔）数次以赶跑加样孔中的气泡；

b) 用移液器将样品依次往凝胶梳孔内加样；

c) 加样完成后，盖上上盖，接上电泳仪[样品由负极（黑色）向正极（红色）泳动]。打开电泳仪电源开关，在电压为 100~150 V（8 V/cm），进行电泳，开始电流恒定在 10 mA，当进入分离胶后改为 20~25 mA（15 V/cm），溴酚蓝距凝胶边缘约 0.5 cm 时，停止电泳。

3.5 染色与脱色

a) 电泳结束后，小心撬开玻璃板，在溴酚蓝区带中心插入金属丝做好标记，在凝胶下部切去一小角以标注方位；

b) 将凝胶放在大培养皿内，蒸馏水洗涤数次后，加入沸水，置沸水浴中，加热5min；取出倒去溶液，置脱色摇床，加入沸水洗涤 2 次（每次 5min）；

c) 加入沸水浴预热的染色液（加入量以淹没凝胶为宜），置沸水浴中染色 5 min；取出置脱色摇床，继续染色 10 min；

d) 染色完成后，将染色液倒去（回收），用蒸馏水漂洗数次后，加入沸水浴预热的脱色液，置沸水浴中脱色 5 min；取出倒去脱色液，置脱色摇床，加入预热脱色液继续脱色，每 30 min 更换一次脱色液，直到凝胶的蓝色背景完全褪去，蛋白质的电泳条带清晰为止。

3.6 实验结果及处理

蛋白电泳图

表四蛋白质迁移率

图十蛋白相对分子质量标准曲线

4 胰蛋白酶动力学研究

材料：

①样品：鸡卵类粘蛋白（X3 纯化的 CHOM 溶液）；胰蛋白酶（X4 纯化的胰蛋白酶 trypsin 溶液）。

②试剂：a) 0.001 M HCl；

b) 0.05 M, pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液：称取 Tris 6.055 g，加入 800

mL去离子水，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节 pH 至8.0，定容至 1L；

c) BAEE底物溶液：称取 BAEE 34 mg，CaCl2 222mg，溶于 100mL 0.05

M, pH 8.0 Tris-HCl（临用前配制，冰箱内可保存 3 天）；

d) 50% TCA。

③仪器设备：移液器；紫外-可见分光光度计；恒温水浴锅。

操作：

4.1 胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数 Km 及最大速率 V 的测定

4.1.1 绘制时间-光吸收关系曲线法

取 2 个光程为 1 厘米的带盖石英比色杯，一个作为空白对照（blank control，B），另一个用来测定（test，T）。两个比色杯按表 X5-1 依次加入缓

冲液和底物溶液，空白对照比色杯中的底物浓度与测定比色杯中的底物浓度相同，在测定比色杯中加入相同体积的酶液，测定

每个底物浓度下的 t-A253 关系曲线，具体操作同 X4 实验中的酶活力测定。

4.2终止法测定胰蛋白酶的Km、最大速率 V 及胰蛋白酶抑制剂的动

力学研究

[1]反应 1 min 时立即加入 50%的 TCA 0.1 mL，混匀终止反应。每反应一管终止一管。

[2]加入的酶液浓度为上次酶活力测定时的浓度[酶活力测定时，前 3 min 吸光度匀速递增，并且ΔA253/min 在 0.05-0.100左右]，CHOM 溶液浓度与酶液浓度一致。请根据自己以前实验数据，自行计算和对酶液和抑制剂（CHOM 溶液）进行稀释。

图四BAEE底物0.40ml光吸收曲线

图五BAEE底物0.6ml光吸收曲线

图六BAEE底物0.8ml光吸收曲线

图七BAEE底物1.00ml光吸收曲线

图八BAEE底物1.20ml光吸收曲线

5 总结

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，每当需要提纯某种蛋白质时，首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质，以便选择最佳的分离纯化方法，从而得到理想的效果。本实验内容较多，步骤复杂，每一步要详细记录实验数据以及各步骤必要的时间，对于较多的试剂应事先做好分类，明确每一步应该加入的试剂及试剂量，防止加错试剂对实验造成的影响。实验过程要严谨，没做错一步，都对下一节实验影响很大。例如：鸡卵粘蛋白提取实验中，取鸡蛋清时应注意不要取出蛋黄。电泳实验中，制胶时要快，避免胶体凝固。总之，随之对蛋白质的研究的深入，在不久的将来一定会有更加简单，更加有效分离蛋白质的方法诞生。

参考文献：[1] 张建社:《蛋白质分离与纯化技术》, 军事医学科学出版社20 09年09月出版。

[2] 周玲仙:《生命的源泉：蛋白质》, 云南大学出版社2010年01

月出版。

谢辞

本实验是在我们的指导老师朱超锋、苟斌全、刘小刚老师的亲切关怀与细心指导下完成的。从实验的开始到论文的最终完成，老师们始终都给予了细心的指导和不懈的支持。老师们对学生认真负责，在他们的身上，我们可以感受到老师们的严谨和务实，这些都让我们获益菲浅，并且将终生受用无穷。实验让我们更好的了解蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义，特别对蛋白质的分离纯化有更深入的认识。

指导老师：朱超锋刘小刚

班级：生物工程⑵班

姓名：陆枫宇

学号：090504021051