5. 亲和层析
5. 亲和层析
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
一、亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。
这种特异可逆结合的物质很多，如抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的这种特异亲和能力又叫亲和力。
亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认为是激素的配体。
其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。
然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。
二、固相载体的选择对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。
一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。
因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。
其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。
连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。
载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。
载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。
再者，载体的组成大小也应均匀。
高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。
配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。
这不是我们所希望的。
一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。
三、配体的选择亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。
配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析法
目
录
亲和层析的基本原理
制备方法
操作步骤
亲和层析的应用
亲和层析能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非
常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门 用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。 相应的配体 底物、抑制剂、辅酶（辅因 子） 所要分离的目的产物 酶
抗体
凝集素 激素
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大
分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。 通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合
适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、
偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白 脱氢酶和激酶 蛋白质 蛋白质 脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内 切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等
辅酶和磷酸酰苷
过渡金属离子（Cu2+等） 组氨酸 肝素
抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结 合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是 以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。 凝集素
5、洗脱
当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时， 可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失 去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否 复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无 亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱， 以备下次使用。
亲和层析的原理
亲和层析的原理
生物分子与亲和层析介质上的配体通过共价键、范德华力、疏水力、静电力等作用发生生物学专一性结合形成复合物，共价链接在载体表面的功能团配体上。
蛋白质亲和层析技术通过目标蛋白质与配体间通过特异性亲和力吸附而达到分离纯化的目的，具有生物专一性的特点，纯化效率高。
亲和层析是一种根据生物分子之间的特异相互作用来分离蛋白的层析方法，如酶和底物、受体和配体、抗体和抗原。
这种作用是特异性的也是可逆的，通过这种可逆的结合和分离来达到蛋白纯化的目的。
亲和层析介质的特点
➤基于配体和分离物间的特异性亲和作用，分离选择性强，效果好，纯化倍数高。
➤能完成一步方法很难完成的分离，如变性和非变性的，功能不同的蛋白。
➤通常一步纯化就可达到>90%的纯度
➤速度快，操作简单。
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法（Affinity chromatography）是一种利用生物分子的特异性相互作用进行分离和纯化的技术方法。
它基于目标分子与固定相上的亲和配体之间的特异性结合，通过这种结合来实现分离和富集目标分子。
亲和层析色谱法的原理是在固定相上引入亲和配体，这些配体可以选择性地与目标分子结合。
固定相通常是一种多孔的或者具有大表面积的材料，如琼脂糖凝胶、硅胶、聚合物等。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和标记物等，它们能够与目标分子发生特异性的结合。
在进行亲和层析色谱时，目标分子溶液会通过固定相，处于非特异性结合的状态下，不与固定相上的亲和配体结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
最后，通过改变溶液条件（如pH、温度等），使得目标分子与亲和配体之间的结合解离。
这样，目标分子就可以从固定相上洗脱出来。
这种方法能够实现对目标分子的高效纯化和富集。
亲和层析色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和制药工业中，用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物分子。
它具有选择性高、纯化效果好、操作简
便等特点，已成为分离和纯化生物分子的重要方法之一。
亲和层析流穿峰的意义
亲和层析流穿峰的意义一、前言亲和层析流穿峰（Affinity chromatography peak elution）是分离纯化生物大分子的一种方法，常用于分离蛋白质。
本文将详细介绍亲和层析流穿峰的意义。
二、亲和层析流穿峰的基本原理1. 亲和层析亲和层析是利用生物大分子与其特异性配体之间的特异性相互作用，使目标生物大分子在混合物中被选择性地结合到固定在某种固相材料上的配体上，然后再通过洗脱等方法将结合的目标生物大分子从固相材料上分离出来。
2. 流穿峰流穿峰是指通过改变洗脱缓冲液pH值或浓度等因素，使得不同组分在不同时间从柱床中洗脱出来。
这种方法可以有效地将杂质去除并且保证目标组分纯度高。
3. 亲和层析流穿峰亲和层析流穿峰是将亲和层析与流穿峰相结合的一种方法。
它可以根据不同生物大分子之间的特异性相互作用，选择性地从混合物中提取出目标生物大分子，并且通过流穿峰的方法将目标生物大分子纯化出来。
三、亲和层析流穿峰的意义1. 提高纯度亲和层析流穿峰可以根据不同生物大分子之间的特异性相互作用，选择性地从混合物中提取出目标生物大分子。
这种方法可以有效地去除杂质，提高目标组分的纯度。
2. 节省时间和成本与其他纯化方法相比，亲和层析流穿峰具有操作简便、高效快速、自动化程度高等优点。
因此，它可以节省时间和成本，并且可以在较短的时间内得到高质量的目标组分。
3. 适用范围广亲和层析流穿峰可以根据不同生物大分子之间的特异性相互作用进行选择性纯化。
因此，它适用于各种类型的生物大分子，如蛋白质、核酸等。
4. 可以与其他技术相结合亲和层析流穿峰可以与其他技术相结合使用。
例如，在蛋白质纯化中，可以将亲和层析与凝胶过滤、离子交换层析等技术相结合，以达到更好的分离纯化效果。
四、亲和层析流穿峰的应用亲和层析流穿峰广泛应用于生物医学领域。
例如，在药物研发中，可以使用亲和层析流穿峰来纯化药物靶点蛋白质；在生物制药领域，可以使用亲和层析流穿峰来纯化重组蛋白质等。
亲和层析
葡聚糖凝胶 商品名:Sephadex 型号:G-100,150,200 型号含义:每克干凝胶吸水量X10 特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔小
四、配基的选择
应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团
以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物 物质的亲和性:
2.豌豆素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照 生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收 集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置 37℃保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔 轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结 果。
亲 和 层 析 Affinity Chromatography
一、概述
亲和层析：是利用生物大分子之间有 专一的亲和力而达到分离纯化的层析 方法
优点：1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的 吸附剂和建立相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
二、基本原理 生物专一吸附
(bioselective adsorption )
1.具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅 酶因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白
2.基本过程： 固相化 (Immobilise)
配基Ligand:亲和层析中能被某一生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基 共价结合,使其固相化的物质。
五、配基的固相化
固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂
过程：活化、接臂
"插入剂"或"手臂"使小分子配基适当的离开载 体骨架,克服载体空间位阻的影响
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加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
3. 柱长的影响
Hale Waihona Puke 4. 温度的影响 GSH-Sepharose 4B亲和层析 分离谷胱甘肽转硫酶 CHOM-Sepharose 4B亲和层析 分离胰蛋白酶
平衡液： 25mmol／L磷酸盐缓冲液， pH7.4(含3mmol／L DTT， 1mmol／L EDTA， 200mmol／L NaCl) 洗脱液： 25mmol／L磷酸盐缓冲液， pH7.4(含3mmol／L GSH， 2mmol／L DTT)
聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶(Ultro-gel)
最常用的几种活化剂： 溴化氰(CNBr) 环氧氯丙烷 1，4-丁二醚 戊二醛、高碘酸盐等。
1
配基的选择
2
3 4
载体的选择
活化剂与偶联反应 封闭
5
亲和介质的技术指标
配基必备条件： ①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影
响配基和目标分子的专一结合特性。
理想载体的特性： ①不溶于水，但具有高度亲水性。 ②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。 ③机械性能良好，在一定静水压下不变形。
④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。
⑤化学惰性 ，无或微弱的非特异性吸附作用。 ⑥有良好的物理和化学的稳定性。
纤维素 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃 琼脂糖凝胶 交联琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶
①有机小分子类 酸类、核苷酸类等。 ②生物大分子类 质、抗原抗体类等。 ③染料 主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等 主要有酶类、抑制剂类、蛋白 主要有苯基类、烷基类、氨基
纤维素(cellulose)
葡聚糖凝胶(sephadex) 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel) 多孔玻璃(Bio-Glass) 琼脂糖凝胶(sepharose)
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
平衡液：0.1mol／L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液(内含0．5mol/LKCl， 50mmol／L CaCl2) 洗脱液：0.1mol／L，pH2.5 甲酸- 0.5mol／L KCl溶液
1. 在亲和层析时，为什么床体积比较小？为什么在此层析 过程中无亲和力的物质往往只能产生一个层析峰？ 2. 简述亲和力层析的分辨率比一般吸附层析高的原因。 3. 简述亲和层析和亲和吸附剂衍生物制备的一般过程。 4. 哪些条件影响载体上配体的偶联量？配体应具备哪些条 件？ 5. 在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、离子交换层 析、凝胶层析有哪些异同点？
亲和层析介质一般保存于溶胀状态，保存温度4～ 8℃，不可冷冻，否则会破坏凝胶的珠状结构。在保存溶 液中加入20％的乙醇或0．02％的硫柳汞以防止长菌。活 化的rhiol-Sepharose 4B或thiopropyl-Sepharose 6B带 巯基的介质不能用硫柳汞。
1. 样液体积的影响 2. 流速的影响
②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。 ③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸
附，且不破坏目标分子的生物活性。
④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。
酶----底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属 离子等） 抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋 白、载体蛋白 外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、 细胞 核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合 蛋白
①凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化， 引入不同的基团。
②具有大孔性和亲水性，凝胶内部的羟基得到 活化，有较高的活化效率。 ③刚性较好，珠状结构对流动向的阻力最小， 分离效率高。 ④非特异吸附极低，理化性质较稳定。
1. 在较广的pH范围内正常工作
2. 对去污剂、解离试剂保持稳定
3. 用0.1mol／L NaOH或0.1mol／L HCl处理2～3h不引起凝 胶颗粒的变化。
4. 不被乙醇、丙酮等有机试剂所破坏。
5. 能耐受6mol／L盐酸胍或7 mol／L尿素处理 6. 吸附剂能够再生并重复使用。
以生物大分子为配基的偶联反应
活化载体“接臂”
①溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应
②环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应
①短臂(未接臂)亲和介质
②长臂(接臂)亲和介质
在弱碱性pH下过夜或在Tris—HCl缓冲液(pH8)中2h被水解。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
（一）生物大分子的识别功能 （二）亲和层析原理示意 （三）亲和吸附剂结构特点
蛋白质的结合部位及各种结合力
酶：底物、抑制剂
底物类物 抗体：抗原、病毒 细胞 激素：受体 外源凝集素 ：糖蛋白 表面受体蛋白 核酸：互补碱基链段 组蛋白
亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主 要有以下几类：
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
二、基本原理 三、亲和层析介质及制备
四、亲和吸附层析实验流程
①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简
单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。
②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓 度的样品，有的纯化倍数达几千倍。
③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较 温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质