实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定
重组蛋白的Dot
重组蛋白的Dot-Western blot 分析【实验目的】熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。
【实验原理】微量重组蛋白（纯化或未纯化的）固定在硝酸纤维素（NC）膜上以后，用脱脂奶粉封闭NC 膜上其他结合位点，利用兔抗重组蛋白的抗体（一抗）可特异与重组蛋白结合的特点，当NC膜与一抗溶液温育时，(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒加慢病毒包装)抗体可特异结合在重组蛋白上，当NC膜再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG的抗体（二抗兔）溶液温育时，则该抗体可特异的与一抗结合，将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中，HRP与二氨基联苯胺（DAB）及H2O2反应生成褐色产物，沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位，故可以检测目的蛋白的存在。
【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装)1．实验仪器微量移液器，脱色摇床2．实验试剂封闭液：5%脱脂奶粉，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；漂洗液：150 mmol/L，NaCl 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；显色液：20mmol/LTris-Cl,pH8.0，0.1%NiCl2 ，0.01% H2O2，0.01% 3,3’二氨基联苯胺（DAB）3．实验材料 1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，1 mg/mL牛血清白蛋白，兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清，羊抗兔IgG的抗体【实验步骤】1．分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白（阴性对照）溶液各2 µL点在NC膜上的两处，用铅笔标记。
(Q往圣科技3452125268提供张峰Science的CRISPR/cas9免费送)2．将NC膜放在一个干净培养皿中，加入20 mL封闭液于脱色摇床上温育1 h。
3．加入10 μL兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清（按照抗体效价调整一抗加入量），混匀，继续摇动2 h。
Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG分子实验报告
Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG摘要：本实验利用Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG，主要包括利用SDS-PAGE进行蛋白质分离之后，将其转移至NC膜上进行蛋白免疫印迹并进行检测，实验中我们用了正常人血清蛋白，肺炎患者，白血病人患者三种血清，使用彩虹Marker，并用其作出标准曲线，以此求出其余IgG的分子质量，并根据不同样本条带颜色，面积等简要判断不同样本LgG含量的多少并给予解释。
关键词：免疫印迹技术；免疫球蛋白；SDS-PAGE引言：蛋白质免疫印迹技术,是1979年斯坦福大学乔治.斯塔克发明的蛋白质印迹法,继southern-blotting 之后起名 Western-blotting,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究,抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，其分析容量大，敏感度高，特异性强，是检测蛋白质性质、表达与分布的一种最常用的方法。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使其去折叠。
聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。
此聚合过程是由四甲基乙二胺和过硫酸胺激发的。
被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。
人血清中含有人类免疫球蛋白，根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类: lgG、lgA、lgM、lgD、lgE、lgG 是血清的主要抗体成分，占血清免疫球蛋白总量的70%~75%。
在电泳之后，利用抗原抗体结合的特异性，进行蛋白免疫印迹。
1.目的与要求a)掌握SDS-PAGE电源分离蛋白的实验技术和操作；并绘制蛋白质标准曲线,求目的蛋白分子量的方法；b)垂直板电泳装置的安装及灌胶；电泳所用试剂的配制；c)了解电泳过程中常见问题的原因及处理办法，不连续电泳系统分离蛋白质的原理以及垂直板电泳装置的安装和灌胶。
基础生物化学实验课件PPT-Western blot 法鉴定目的蛋白的表达及表达量大小
Bio Rad Trans-Blot Plus Cell
1．染胶 用考马斯亮兰染色，经脱色液脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。
2．染膜 有两类染液选择，可逆的和不可逆的。不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、
Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。可逆的有丽春红染色液 （ponceau-s red）、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗 掉，膜可以用做进一步的分析用。将薄膜漂在ponceau-s red中快速染色，直至分 子量标准显现时取出，记录下标准位置。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白 质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
5. Hold the cover level and slide it gently down onto the stack.
6. weigh down the lid in order to ensure even contact with the stack.
7. Connect the unit to a suitable power supply.
• Western blot analysis can detect one protein in a mixture of any number of proteins while giving you information about the size of the protein.
• It does not matter whether the protein has been synthesized in vivo or in vitro.
结合率：80－150 ug Pr/cm2
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
第五部分重组蛋白的Western Blotting
“夹心饼”的制作（1）
4. 次序：负极（黑孔板）－> 纤维垫->1－ 2张滤纸->凝胶->PVDF膜-> 1-2张滤纸-> PVDF 纤维垫->正极板（白孔板）－>扣上吊扣 －>插进转膜槽中。
“夹心饼”的制作（2）
_ +
纤维垫 PVDF膜 滤纸
凝胶
电转移
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按上示意图，接上电源（凝胶一边接负 极，纤维膜一边接正极），恒流电泳2小 时，电流为：膜面积(cm2)x2mA。 关闭电源，将膜取出，观察预染蛋白 marker 的转移情况。
试 剂
5． AP底物显色液: 5mL AP substrate buffer + 50uL NBT solution + 50uL BCIP solution (用前配制） 7． SDS-PAGE电泳用溶液和试剂（上周已 配好）。
器 材
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SDS-PAGE电泳装置一套 电转移膜装置 抗体-酶反应摇床 杂交盒 其它
实验安排
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第一天上午：（1）SDS-PAGE, （2）转移 缓冲液和洗膜液配制； 第一天下午：蛋白转移，封闭过夜（？） 第二天：杂交、显色、结果观察、拍照。 上交实验报告：下周二前交到211室伍俭儿 老师处。
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建议的点样次序
不 诱 导 诱 导 上 清 穿 流 峰 纯 化 正 对 照 M
�
封闭与杂交
mL封闭液，置脱色摇床中 6. 将膜放入塑料盒中，加入20 20mL 缓慢摇动，室温1小时或4℃（层析冷柜）封闭过夜。 〈三〉靶蛋白与第一抗体结合 7 ．弃去封闭液，用 Blocking solution 稀释一抗（ 1 ： 400 = 40ml, 全班用），分2份各20mL加入盒中，室温平缓 摇动温育 1 小时。然后尽量回收抗体溶液， - 20 ℃ 保 存，可重复使用。 用TBST室温洗膜3次，每次20mL/10 min－15min。
westernblotting实验操作步骤讲解
westernblotting实验操作步骤讲解蛋⽩免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋⽩样本通过聚丙烯酰胺电泳按分⼦量⼤⼩分离，再转移到杂交膜上，然后通过⼀抗/⼆抗复合物对靶蛋⽩进⾏特异性检测的⽅法。
WB 是进⾏微量蛋⽩质分析⽐较成熟的技术之⼀。
以下是总结Western Blot 操作⽅法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A第⼀部分：蛋⽩样本提取制备蛋⽩样品制备是Western Blotting的第⼀步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取⽬的蛋⽩（通过采⽤不同提取⽅法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋⽩处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表⾯活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防⽌蛋⽩降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加⼊合适的蛋⽩酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等⼲扰分⼦（通过加⼊核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
⽅法的选择◆⾃⾏配制抽提试剂，根据⽂献⽅法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的⽅法提取。
Example 1：实验中提取肾脏总蛋⽩，具体实验过程如下：1.提前⼀天4℃解冻RIPA，⼀定要完全融化；配PBS（⽤于细胞试验则需⾼压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临⽤临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离⼼10min，取上清。
4.蛋⽩定量：取少量上清稀释30倍蛋⽩定量，然后计算出各样本原液蛋⽩浓度。
注意由于裂解液⾥含有较⾼浓度的洗涤剂，蛋⽩定量不能选⽤Bradford法，可以选⽤改良的Lowry’s法或者BCA法。
5.样品蛋⽩浓度均⼀化：根据蛋⽩定量计算的结果将各样品蛋⽩浓度调整⼀致。
实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定
实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定一、实验内容1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
2．重组蛋白的Western boltting鉴定。
二、实验要求通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。
三、实验方法1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析（1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。
（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。
（3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。
（4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。
（5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。
将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。
（6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。
2．Western blot分析（1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。
（2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。
a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。
b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。
c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。
d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。
（3）杂交a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。
b.TBST漂洗3 × 10 minc.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中，室温反应1 hr。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项 -回复
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项-回复西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项引言：蛋白质是细胞功能的重要组成部分，对于研究蛋白质的表达和功能非常关键。
西方博LOT（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于分析特定蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的大小和相对丰度以及判断蛋白质的分子量。
本文将介绍西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项。
一、实验结论：1. 确定目标蛋白质的存在与否：在Western blot实验中，通过探针的特异性结合，可以确定目标蛋白质在待检样品中的存在与否。
如果探针与待检样品中的蛋白质结合，会出现特异的蛋白质带，从而可以确定目标蛋白质的存在。
2. 确定目标蛋白质的大小和相对丰度：通过Western blot实验的结果，可以确定目标蛋白质的大小和相对丰度。
在蛋白质电泳分离后，较大的蛋白质会相对较靠近电极负极，较小的蛋白质会相对较靠近电极正极。
通过与已知分子量蛋白质标准曲线的对比，可以确定待检样品中目标蛋白质的分子量。
3. 分析蛋白质的表达水平：通过Western blot实验的结果，可以分析目标蛋白质在不同样品中的表达水平。
通过比较待检样品中蛋白质带的强度，可以初步判断蛋白质的相对表达量。
进一步，可以使用图像分析软件对蛋白质带的强度进行定量分析，获得更精确的表达量数据。
二、实验注意事项：1. 样品处理：西方博LOT实验的样品处理是关键的一步。
样品的存储和处理方式可能会对实验结果产生影响。
为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样品应尽快冷冻保存，并在实验前严格遵循相关处理方法。
2. 磷酸盐缓冲液的配制和pH调整：磷酸盐缓冲液是Western blot实验中的关键试剂，用于制备电泳缓冲液、转膜缓冲液和洗涤缓冲液。
正确配制磷酸盐缓冲液的浓度和pH值是确保实验的准确性和稳定性的重要因素。
3. 蛋白质的电泳分离和转膜：蛋白质的电泳分离要求严格的电泳条件。
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实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定
一、实验内容
1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
2．重组蛋白的Western boltting鉴定。
二、实验要求
通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。
三、实验方法
1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析
（1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。
（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。
（3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。
（4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。
（5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。
将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。
（6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。
2．Western blot分析
（1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。
（2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。
a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。
b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。
c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、
凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。
d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。
（3）杂交
a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。
b.TBST漂洗3 × 10 min
c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中，
室温反应1 hr。
d.TBST漂洗3 × 10 min
e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG
二抗工作液中，室温反应1 hr。
f.TBST漂洗3 × 10 min。
（4）显色
将膜浸泡在DAB显色液中，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。
（5）拍照和保存结果。
附：
溶液配制
电转移缓冲液
48 mmol/L Tris
39 mmol/L 甘氨酸
0.01% SDS
20% 甲醇
TBST
20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.5
0.15 mol/L NaCl
0.05% Tween-20
Western blot封闭液：TBST + 5%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白
抗体稀释液：TBST + 1%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白
DAB显色液：二氧基联苯胺，Diaminobenzidine
由图可知，重组蛋白的分子量约为45KDa，由IPTG诱导表达的全菌、上清和沉淀均有表达，由乳糖诱导的仅在全菌和上清中有表达（与没有诱导的进行比较）。
由图可知，重组蛋白的分子量约为45KDa，IPTG诱导的重组蛋白均有表达，且上清表达量高，而乳糖诱导的表达仅在上清和全菌中，而且表达量比IPTG诱导的效果差。