大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒
QIAGEN 中文版去内毒素大提试剂盒
纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作：1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养补充：1.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合2.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA3.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制4.准备1个冰浴盒用于步骤65.准备室温下的异丙醇10.5ml6.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤：peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。
(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。
(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。
提取质粒实验报告
提取质粒实验报告提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，通过提取质粒，可以获得目标基因的DNA序列，进而进行进一步的研究和应用。
本实验旨在通过一系列步骤，从细菌中提取质粒，并对提取的质粒进行分析和鉴定。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 大肠杆菌培养液- 质粒DNA提取试剂盒- 离心管- 离心机- 试剂盒中的缓冲液、溶解液、洗涤液、洗涤缓冲液、洗涤液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液2、洗涤缓冲液浓缩液3、洗涤缓冲液浓缩液4、洗涤缓冲液浓缩液5、洗涤缓冲液浓缩液6、洗涤缓冲液浓缩液7、洗涤缓冲液浓缩液8、洗涤缓冲液浓缩液9、洗涤缓冲液浓缩液10- 水浴锅- 离心管架2. 实验方法：- 步骤一：将大肠杆菌培养液离心，收集菌体沉淀。
- 步骤二：将收集的菌体沉淀加入溶解液中，使其充分溶解。
- 步骤三：加入缓冲液，进行离心分离。
- 步骤四：将上清液转移到新的离心管中，加入洗涤液进行洗涤。
- 步骤五：加入洗涤缓冲液进行洗涤。
- 步骤六：加入洗涤缓冲液浓缩液进行洗涤。
- 步骤七：加入洗涤缓冲液浓缩液2进行洗涤。
- 步骤八：加入洗涤缓冲液浓缩液3进行洗涤。
- 步骤九：加入洗涤缓冲液浓缩液4进行洗涤。
- 步骤十：加入洗涤缓冲液浓缩液5进行洗涤。
- 步骤十一：加入洗涤缓冲液浓缩液6进行洗涤。
- 步骤十二：加入洗涤缓冲液浓缩液7进行洗涤。
- 步骤十三：加入洗涤缓冲液浓缩液8进行洗涤。
- 步骤十四：加入洗涤缓冲液浓缩液9进行洗涤。
- 步骤十五：加入洗涤缓冲液浓缩液10进行洗涤。
- 步骤十六：将洗涤后的质粒DNA溶解于水中。
实验结果与讨论：在本实验中，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA，并进行了分析与鉴定。
通过对提取的质粒DNA进行电泳分析，我们观察到了明显的DNA条带，表明质粒DNA的提取是成功的。
此外，我们还对提取的质粒DNA进行了鉴定。
通过使用限制性内切酶对质粒DNA进行切割，并进行电泳分析，我们可以确定质粒中是否存在目标基因。
QIAGEN Plasmid Kits(德国凯杰质粒提取试剂盒说明书中文翻译)
QIAGEN Plasmid Mini,Midi,and Maxi Kits（说明书中文翻译版）Plasmid Midi Kit(cat.Nos.12143and12145)The kit can be stored at room temperature(15~25℃)for up to2years.使用前的注意事项：（1）将Rnase A solution加入Buffer P1中，混匀，2~8℃储存。
（2）可选步骤：按1:1000的比例将LyseBlue试剂加入到Buffer P1中。
（3）使用前在4℃预冷Buffer P3，检查Buffer P2是否出现SDS沉淀。
（4）需准备好异丙醇和70%酒精。
（5）标志：圆形代表小提试剂盒；三角形代表中提试剂盒；正方形代表大提取试剂盒。
表1推荐LB培养物体积试剂盒高考倍质粒低拷贝质粒小提3mL不推荐中提25mL100mL大提100mL500mL具体操作步骤：1.收取过夜培养的细菌培养物，在4℃条件下6000×g离心15min。
2.（弃去上清液）使用4mL Buffer P1重悬菌体沉淀。
3.加入4mL Buffer P2，颠倒4~6次使彻底混匀，室温（15~25℃）孵育5min。
注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液会变蓝。
4.加入4mL预冷过的Buffer P3，颠倒4~6次使彻底混匀，冰上孵育15min。
注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液混匀后直至蓝色消失。
5.在4℃条件下≥20000×g（14000×g）离心30min。
6.平衡柱子QIAGEN-tip100：加入4mL Buffer QBT，通过重力流使液体过柱。
7.将第5步的上清液转移至QIAGEN-tip中，使其依靠重力流通过柱中的树脂。
8.使用10mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip，使Buffer QC依靠重力流通过柱中的树脂。
洗涤2次。
质粒大抽 protocol(用QIAGEN Maxi Column)
质粒大抽protocol(用QIAGEN Maxi Column)2003/4/28陈俊1. 从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到3ml选择性培养基，摇床培养14小时,225 rpm。
2. 从小量培养物中取1ml用作小量抽提，并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的培养物，以1：1000接种到100 ml选择性LB培养基中，摇床培养14小时,225 rpm。
3. 从大量培养物中取700微升菌液和300微升甘油（灭菌）加入冻存管，放入液氮中，过夜后，放入-70℃冰箱中。
并且在stocklist中加入菌种的详细信息(stocklist 贴在冻存管的上方)。
4. 把100ml的菌液倒进250ml离心管中，4℃离心，6000g离心15分钟（No41 rotor 8500rpm）。
5. 倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（确定是否加了RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。
然后将悬浮液转到50ml的离心管中。
6. 加入4ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4-6次，在室温下孵育不要超过5分钟（从开始加P2时计时，时间太长会使质粒DNA断裂）。
样品不要斡旋，buffer P2用毕也要及时盖好盖子，以免被空气中的CO2酸化。
7. 加入4ml 预冷的PH调节液buffer P3,及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4-6次，在冰上孵育15分钟。
后再一次混匀样品．20000g，4℃离心30分钟（N046 rotor 18000 rpm）.若上清不够清需再离心15min. 此步可对上清取样240ul （sample 1）以备检测分析8. 在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。
用4ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。
QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。
选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。
2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。
5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。
如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
大型大量质粒提取试剂盒操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://PhasePrep EndoFree Maxi Kit大型/大量质粒提取试剂盒目录号：PL1401适用范围：适用于大量高纯或者转染级质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存20次（PL1401）RNaseA（10mg/ml）-20℃ 1.3ml溶液P1 4℃130ml溶液P2 室温100 ml溶液PⅢ室温110 ml杂质清除剂A 室温 3 ml杂质清除剂B 室温30 ml内毒素清除剂-20℃10 ml本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg /ml）置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.内毒素清除剂在4℃可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在－20℃!3.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。
纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。
纯化后期过程均在1.5ml 小离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完全回收细菌裂解释放出的质粒，不必担心质粒DNA的丢失。
本方法提取纯化质粒DNA，对质粒损伤小，即使是10kb甚至100kb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。
QIAGEN-中文版去内毒素大提试剂盒
纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作:1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选: 加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养1.补充:2.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液, 2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合3.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯, 因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA4.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制5.准备1个冰浴盒用于步骤66.准备室温下的异丙醇10.5ml7.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤: peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落, 2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm, 注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。
(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。
(孵化容器容积至少4倍于培养液, 培养至细菌密度约3-4×109/ml, 即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水, 用1 N NaOH 调pH值至7.0, 用蒸馏水调整至1L。
qiagen大量抽提质粒
qiagen的大量抽提试剂盒是公认效率最高，得率最高的产品。
我做的研究工作主要是基因治疗，抽提质粒是一件非常痛苦的事情。
因为要做动物的体内实验，每只动物每次需要将静脉注射50微克的质粒，重复注射三次，每只就是150微克，如果有60只就需要9mg。
如果需要大量抽提质粒的实验人员就清楚这9mg是需要多大的工作量。
并且需要提出的是静脉注射动物用的质粒是需要去内毒素的，目前去内毒素最好得率最高的非qiagen莫属。
该公司的endofree plasmid purification 是国外文献最常用的大量抽提质粒的产品。
其中以maxi,mega最为常见。
我就我自己最常用的mega使用的经验说一下。
在qiagen 公司的可以下载到非常详细handbook，/literature/handbooks/INT/plklit.aspx其中非常专业及丰富的质粒的知识，对于每一个初学者是必需通读一遍的，同样对于其他人员也是很有帮助的。
要有高产率高质量的质粒，以下几个关键点要注意：1. 准备好需要的器材，根据qiagen的mega 的protocol，是需要与tip相连的广口瓶，口径是45mm这是因为tip必需与这种瓶才能配套，对于操作抽真空过滤这一步可以方便快速，减少不必要的麻烦。
2. 质粒最好是高拷贝的，感受态细菌最好是极高拷贝的。
如top 10等，DH5-alfa 稍差一些。
感受态细菌最好是刚做不久的。
3. 每次培养的菌体量在600ml以下，LB注意水质一定要好，一定要PH值在7.2－7.4，摇床在250转/分钟，16小时以上，注意菌体的浓度一定要浓。
4. 操作过程一定要按照操作说明的时间，严格操作。
要注意一点加入酸中和后在tip的时间要短，因此需要快速抽真空，快速的转入下一步。
5.洗脱的时间很长，要有耐心，不要让下流的洗脱液停止。
6.异丙醇沉淀DNA后离心可在20000转/分，离心45分钟可以提高约20％产量。
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质粒抽提一、溶液及培养基配制：1、LB液体培养基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。
C、定容。
D、加塞、包扎。
F、高压灭菌121℃，30min，灭菌后室温保存备用。
若要分装需要在超净台内。
G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP）。
先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。
（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 5g/L胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L氨苄青霉素溶液100µg/ml（终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基）琼脂粉15g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。
C、5mol/L NaOH溶液调pH到7.4。
D、定容。
E、分装、加塞、包扎。
F、高压灭菌121℃，30min。
G、灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中（或室温），待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。
（3）倒板：一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4℃保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。
首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。
小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。
转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐；注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。
所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP；蓝黄白枪头至少个一盒，备用；1.5ml doff管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液枪，则先灭菌5ml枪头）；超纯水和TE bufferStep1：转化:事前准备的：提前将固体培养基至于超净台中，使之回复室温；灭过菌的L形玻棒，确认微生物室有灭过菌的；灭过菌烘干的进口1.5ml doff管足量；100μL枪及灭菌黄枪头（微生物室或许有），10μL枪及灭菌白枪头；Marker笔烧杯，温度计小冰盒以及冰注意感受态融化需要时间，可以先将感受态取出融化的时间内做其他准备工作感受态提前半小时从-80冰箱取出插到冰里融化，半融化即可（冰内30min即可）。
将冰箱里的固体培养基，灭过菌烘干的进口1.5ml doff管，灭过菌的L形玻棒，枪及枪头取出备用。
感受态融化后将其分装，50µl/管（注意在加质粒前在各个管子上标注好要加入的质粒名称以防混淆）。
每个管加3µl质粒，轻轻吹打均匀，冰上静置30min 。
42℃水浴放置90秒后迅速拿出，插到冰里。
铺板，每个质粒铺5µl/板。
放置过夜。
所有操作尽量在超净台内完成，避免杂菌污染。
Step2：小摇及大摇事先准备：灭过菌的加过AMP的LB液体培养基，每个质粒至少250ml左右；15ml离心管；灭过菌的250ml及500ml或1000ml锥形瓶灭过菌的白枪头及枪；灭过菌的蓝枪头及枪；marker笔，医用胶带，封口膜，垃圾袋灭过菌的锡箔纸申请Beckman离心机，借Beckman离心机专用离心管，为第二天抽提做准备1、观察菌落生长状况，若无异常，准备小摇。
2、准备LB液体培养基（灭菌，AMP），分装至50ml离心管中（注明使用与否、加氨苄量、配制时间等），可在4度冰箱内储备使用；将15ml离心管上按待扩增质粒名称做好标记。
3、从分装的50ml离心管中，向15ml离心管中加入2ml液体LB（灭菌，AMP）培养基（注意尽量不要留在瓶壁上）。
多余培养基使用后封口，4度保存。
4、以孤立的菌落点为目标，用枪头（推荐白枪头）刮取微量菌落，溶于2ml培养基中。
将离心管盖子拧松后用胶带固定5、小摇，时间以具体情况定。
一般从上午10点左右开始小摇，到当天下午5点可以准备大摇。
6、封好固体培养基，放回4度冰箱，收拾好微生物室台面，清理废液缸及垃圾桶（为了以后能顺利申请到）7、小摇成功后，液体LB（灭菌，AMP）培养基，每250ml分装于500ml或1000ml 锥形瓶中（瓶越大，培养基震荡越充分），不需严格定量。
将小摇完成的培养基加入大锥形瓶中（注意在瓶上做好相关标记），灭菌过的锡箔纸包裹瓶口，大摇，过夜。
Step3：质粒抽提（大提，若为中提或小提具体看说明书）（使用进口器材）注意及时申请Beckman离心机，除了20000g转速必需，其余6000g转速可以用张评浒老师德尔Sigema离心机代替；准备好试剂盒，检查试剂盒中各个试剂是否足够，每个质粒Buffer P1（4度预冷）10ml，Buffer P210ml，BufferP3（4度预冷）10ml，Buffer QBT 10ml，BufferQC 60ml，Buffer QF15ml。
准备足量50ml离心管，每个质粒至少需要7个离心管；准备足量的灭菌doff管灭过菌的移液管及电动移液器（若无，可用1000微升枪及灭过菌的蓝枪头代替）冰及冰盒1000微升枪及灭过菌的蓝枪头灭过菌的超纯水，无水乙醇，未灭菌的TE buffer以及灭过菌的TE buffer（细胞房冰箱有，若无可用滤器制备一些），异丙醇，3M乙酸钠1、将大摇完成的瓶子中的培养基分装到5个50ml离心管中，此时培养基浑浊。
2、Beckman离心机，Beckman离心管，6000g、4℃、15min。
（提前一天申请离心机的使用），需分批离心。
离心后尽快，小心地弃上清。
3、加入4℃预冷的Buffer P1 10ml，重悬大肠杆菌。
由于菌分装在若干离心管中，先将10ml加入一个离心管中，吹起沉淀的菌，吹匀，加到另一个离心管里，再吹，依次将菌全部收集到Beckman离心管。
4、加入Buffer P2 10ml，翻转混匀4-6次，室温（15-25℃）孵育5min。
5、加入4℃预冷的Buffer P3 10ml，翻转混匀4-6次，冰上孵育20min。
6、离心，使裂解的大肠杆菌沉淀，20000g、4℃、30min。
7、将上清转移到50ml离心管中，二次离心，6000g、4℃、30min。
8、安装QIAGEN-tip。
*9、向tip中加入10ml Buffer QBT，随重力流下，以平衡tip。
10、小心加入第7步得到的上清，注意不能让沉淀漂起，否则要再离心。
随重力流下。
质粒将留在树胶滤器中。
11、向tip中加入2×30ml Buffer QC，随重力流下12、将15ml 65℃预热的Buffer QF加入tip，于tip下安置50ml离心管，接滤出的液体，含质粒。
13、向含质粒的滤出液中加入10.5ml，即0.7倍QF体积的异丙醇，以使DNA沉淀。
加入后6000g、4℃、1h。
小心地弃去上清（注意离心之后立即倒净异丙醇，否则沉淀将漂起）。
14、向50ml离心管加入400µl未灭菌的TE buffer，吹起，溶解，转移至1.5ml 进口灭菌doff管。
室温静置30min。
15、向doff管中加60µl乙酸钠和650µl无水乙醇，出现沉淀。
10000rpm，4-8℃，10min。
（离心机预冷）16、尽可能的吸去上清。
加入75%乙醇1ml（已灭菌分装的超纯水250µl+无水乙醇750µl，混合于灭菌的进口doff管，注意应当先在另一个灭菌doff管中配好，绝不可先向沉淀里加水，否则即便加了酒精，沉淀也很难析出），10000rpm，4-8℃，5min。
尽可能吸去上清乙醇，然后重复以上离心，尽可能吸去上清乙醇。
最后放置超净台中风干（最大风量约15-20min）。
17、加150µl灭过菌的细胞房存放的TE buffer，溶解后封口膜封口，-4℃保存1-2天，待其完全溶解后测定吸光度。
测定吸光度后-20℃保存。
具体要求何种浓度为提取成功，依据后续细胞转染实验要求而定（参考值为1μg/ml）Step4 浓度测定1、准备比色皿，PCR用2.5µl、100µl枪及相应灭过菌的进口枪头，面巾纸，新鲜的超纯水。
（注意防护，戴口罩，最好用酒精擦拭附近桌面，老师建议可以在超净台内吸取所需质粒提取液，取出来测）2、打开仪器，选择“DNA”，“Dilution”保持为“100”。
若浓度较低，测不出浓度，则换稀释比例“Set up”→“enter”，选择“Dilution”→直接输入50 →“enter”，操作依旧，先调零，后测定，但是98μL水+2μL样品。
其他稀释度如此。
3、洗净比色皿，反复洗三次，挥干水分。
加入99µl水。
放入仪器，“Ref”调零。
4、调零后，加入1µl样品，放入仪器，按“DNA”or“Enter”5、记录浓度，280/260、260/230。
260/280最好在1.9-2.0之间，而260/230最好在2.0以上。