荧光漂白恢复技术PPT

（PLoS ONE |August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e22962）
Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at 37℃ in the presence of 5% CO2.
（1）注意实验温度的控制。 （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而 定。 （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂 白后的荧光淬灭。
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FRAP技术的不足之处
第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能 观察单个蛋白的移动。 其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部 条件的限制。
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530–600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1–2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were measured by bleaching fixed cells (Fig. 1). ImageJ [32] was then used to construct an average shape and intensity profile of that region.
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漂白区域的荧光强度随时间的 变化示于图2.11。
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漂白以后恢复过程荧光强度的变化 示于图2.13。
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漂白区域在漂白前后的荧光强度 随时间的变化示于图2.14。
说明：细胞膜具有流动性， 膜表面上Fc受体能够迁移。
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Protein Diffusion in Mammalian Cell Cytoplasm
FRAP关键技术简介
FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁 移特性的技术。
当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内 分子的定性知识，基本了解了各细胞器的分子组成，找到许多在细胞生命 周期中发挥重要作用的蛋白质，确认了许多重要蛋白质之间相互作用的存 在并初步描绘出一些信号通路。 但细胞的各种生物学功能和现象都是借助相关分子实现的，当前的研究重 点和难点就集中于解答分子实现各种功能的机制。
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FRAP 的应用
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荧光漂白恢复测定巨噬细胞Fc受体的荧光恢复率和运动分数
（山东大学硕士学位论文《荧光漂白恢复测定巨噬细胞Fc受体的流动性》，李建业，2005.5）
采用Alexa 488标记的羊抗鼠IgG间接标记巨噬细胞Fc受体，用激光共聚 焦系统的强脉冲激光漂白，弱强度激光扫描，光电倍增管(PMT)检测， Fluoview软件记录数据并分析处理。
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FRAP技术的基本要求
选择合适的荧光探针
具备精确可控的激光激发和荧光检测设备
激光扫描共聚焦显微镜
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FRAP 的三个阶段
漂全细胞
使用强激光在短时 间内扫描漂白区域
用尽可能弱的 激光扫描全细胞
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注：
漂白前和漂白后恢复都用尽可能弱的激光扫描全细胞，目的是 得到扫描图像而不引起荧光淬灭，
漂白阶段则使用强激光在短时间内扫描漂白区域，目的是使区 域内的荧光全部淬灭。
在整个过程中，监测漂白区域在各时间段的荧光强度变化并绘 制曲线，从恢复曲线及其数据就可以得到关于分子迁移速率、 动态分子比例等信息。
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FRAP实验注意事项
做FRAP实验还应当注意以下几点，否则就易得到错误结果。
这就需要掌握活细胞生理状态下分子运动的各种信息，近年来发展的一些 技术手段为获得有关重要信息提供了有力的工具，FRAP技术就是其中一 种重要方法。
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FRAP原理
In FRAP, a region of the cell is exposed to high-intensity laser light, causing the fluorophores within that region to irreversibly lose their ability to fluoresce. Recovery of fluorescence in that region yields information about molecular diffusion and binding in the cell.