色谱法概论

第一节：概述一、色谱法的由来1903年俄国植物学家茨维特 （Tsweet）将CaCO3装入竖直的玻璃 管，在顶端加入植物色素后，用石油 醚进行洗脱，在管的不同部位形成不 同颜色的色带，1906年在其发表的论 文中将其命名为色谱 （chromatography）。

色谱分析法概论12固定相（stationary phase）：固定不动的 一相，成为固定相 流动相（mobile phase）：携带样品流经 固定相的流动体，称为流动相二、色谱法的现在现在：一种重要的分离、分析技术 分离混合物各组分并加以分析 固定相——除了固体，还可以是液体 流动相——液体、气体或超临界流体 色谱柱——各种材质和尺寸 被分离组分——不再仅局限于有色物质34三、色谱法的定义和用途（一）定义： 同一时刻进入色谱分析系统的混合物，与固定相和流动相发生 相互作用，由于各组分理化性质不同，混合物被分离，然后依次流 出分析系统，进而进行定性和定量分析的方法。

色谱法又称为层析法（二）用途 1、分离混合物 2、进行定性和定量分析分离• 分析 • 鉴定 • 纯化混合物单一组分• 定量561四、色谱法特点（一）优点：“三高”、“一快”、“一广” 1、高选择性——可将性质相似的组分分开 2、高效能——分离效果 3、高灵敏度——10-11~10-13g 4、分析速度快——几~几十分钟完成分离 5、应用范围广——气体，液体、固体物质化学衍生化再色谱分离、 分析 （二）缺点：对未知物分析的定性专属性差，需要与其他分析方法 联用（GC-MS,LC-MS）。

7第二节：色谱过程和基本原理一、色谱过程由于结构和性质的不同，样品各组分与固定相作用的类型、强 度也不同，结果在固定相上滞留时间的长短也就不同，或被流动相 携带移动的速度不同，即产生差速迁移，因而被分离。

8二、色谱流出曲线和有关概念（一） 色谱流出曲线和色谱峰 1、色谱流出曲线 （chromatogram）：检测器输出的信号强度对时 间作图所绘制的曲线，又称色谱图。

色谱过程示意图9102、基线（baseline） 是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线，稳定的基线应 该是一条平行于横轴的直线 基线漂移 基线噪音3、色谱峰 （1）流出曲线上突出的部分，是组分流经检测器时产生的信号 （2 ）表征色谱峰的三项参数： 峰高或峰面积——用于定量分析 峰位——用保留值表示，用于定性分析 峰宽——用于衡量柱效 （3）峰型： 正常峰——正态分布 拖尾峰——前陡峭后缓慢 前延峰——前缓慢后陡峭11122（4）对称因子（symmetry factor，fs）（二）保留值1、保留时间（retention time;tR）：从进样到组分在柱后出现浓度极 大时的时间间隔，即从进样开始到组分色谱峰顶点的时间间隔。

2、死时间（dead time;t0）：分配系数为零的组分即在固定相上没有 保留组分到达检测器的时间 3、调整保留时间（adjusted retention time; tR’）被固定相保留的组分 比不保留的组分多停留的时间W ( A + B) f s = 0.05 h = 2A 2A正常峰：对称因子0.95～1.05 拖尾峰：对称因子>1.05 前延峰：对称因子<0.95 AWh/2 0.05h W0.05h Bht R ' = t R − t013 144、死体积（dead volume;V0）V0 = t0 FcR5、保留体积（retention volume;VR） V= tR Fc6、调整保留体积（adjusted retention volume; VR’）VR ' = VR − V0 = t R ' FcFc——流动相的体积流速R2 R2 7、相对保留值（relative retention; r） r = t ' = V ' R1 R1t'V'1516（三）色谱峰高和峰面积 峰高（peak height; h） 峰面积（peak area; A）（四）色谱峰区域宽度 有三种表示方法： 1、标准偏差（σ）：0.607h处的峰宽度 的一半 2、半峰宽（W1/2）：峰高一半处的宽 度 3、峰宽（基线宽度）（W）： W =1.699 W1/217183（五）分离度（Resolution, R） 反映组分在色谱中的分离情况R = tR (W12R=0.75− t R1 )2− t R12+ W) / 2t R2=2 (tR W12+ WR=1t R1R=1.5W1W2定量分析时，规定R≥1.5（2005版药典）19 20分离度计算示意图三、分配系数和色谱分离（一） 分配系数和保留因子 1、分配系数K：在一定的温度和压力下，达到分配平衡时组分在固 定相（s）和流动相（m）中的浓度比分配系数讨论： 与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 实验条件固定，K仅与组分性质有关; 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢，保留时间越 长； 组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。

C K = Cs m21222、保留因子k：在一定温度和压力条件下，达到平衡时，组分在固 定相和流动相中的质量之比。

（又称质量分配系数或分配比或容量 因子）（二）保留因子与保留时间的关系k=ms CV = s s mm CmVmk =tR − t0 t′ = R t0 t03、分配系数K和容量因子k的关系k值越大，保留时间越长k=KVs Vm23 244（三）色谱分离的前提 分配系数（保留因子）不相等是色谱实现分离的前提 K（k）相同，样品组分在色谱柱上保留时间相同 K（k）相差越大，越容易实现分离第三节：基本类型色谱方法及其分离机制一、色谱法的分类（一） 按流动相与固定相聚集状态分类 气体：GC Gas chromatography 流动相 液体：LC 气固色谱法 气液色谱法液固色谱法 Liquid chromatography 液液色谱法 超临界流体：SFC Supercritical fluid chromatography2526（二） 按操作形式分类 GC 柱色谱法 操 作 形 式 平面谱法 HPLC SFC 纸色谱( PC) （paper chromatogrpahy） 薄层色谱(TLC) (thin layer chromatography) 薄膜色谱 毛细管电泳法27经 典 柱 色 谱 柱 G C 毛 细 管 柱H P L C 柱 制 备 型 柱 分 析 型 柱28毛细管电泳法纸色谱装置 TLC薄层板及展开装置29 305（三）按分离机制分类 分配色谱法： 吸附色谱法： 分离机制 利用分配系数的不同 利用物理吸附性能的差异二、分配色谱法利用被测组分在固定相和流 动相中溶解度差别实现分离，即 在两相中的分配系数差别实现分 离。

气液分配色谱 液液分配色谱离子交换色谱法： 利用离子交换原理 空间排阻色谱法： 利用排阻作用力的不同 其它方法：亲和、手性色谱法等载体31固定相样品分子流动相32分配系数K三、吸附色谱法利用被测组分对固定相表面吸K=各组分分配 系数不同Cs Cm随流动相迁 移速度不同 各组分 分离附中心的吸附能力差别实现分离 气固吸附色谱法 液固吸附色谱法 流动相在固定相中溶解度大的组分迁移速度慢， 溶解度小的组分迁移速度快33固定相（吸附剂）样品34吸附系数Ka[ X a ]为溶质分子在吸附剂表面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中的浓度 S a为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积四、离子交换色谱法利用被测组分与固定相（离子交换树脂）离子交换能力的差别 而实现分离 选择性系数Ks[ X ][Y ]n X S Ka = a m n = a a [ X m ][Ya ] X m Vm各组分吸附 能力不同 吸附系 数不同Ks =随流动相迁 移速度不同 各组分 分离[ RX + ] [X +]（阳离子交换树脂） 各组分 分离36在吸附剂上吸附能力强的组分迁移速度 慢，吸附能力弱的组分迁移速度快35组分离子交 换能力不同选择性系 数不同随流动相迁 移速度不同6五、分子排阻色谱法根据样品分子的大小进行分离 渗透系数Kp六、不同色谱法比较分离方法 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱 分离原理 溶解性 吸附性 电荷强度 扩散性 相平衡常数 分配系数 吸附系数 选择系数 渗透系数 广义分配系数 在一定的温度和压力 下，分配达到平衡时 组分在固定相和流动 相中的浓度比[X ] Kp = s [Xm]各组分大小 不同 渗透系 数不同 随流动相迁 移速度不同 各组分 分离3738第四节：色谱法的发展概况一、发展历史始于20世纪初茨维特分离色谱； 30年代相继出现了薄层色谱与纸色谱； 1941年，Martin和Synge发现液液分配色谱法，并于1952年获得 Nobel奖 1952年Martin和James创立气液色谱法，50年代建立了各种气相色 谱法和色谱理论60年代气相色谱-质谱联用； —气相色谱法的鼎盛时期-石油工业的需要 70年代高效液相色谱； 80年代末超临界流体色谱、高效毛细管电泳3940二、发展趋势新型固定相 新型检测器 色谱新方法：HPCE、CEC、μ-TAS、lab-on-chip 色谱联用技术 色谱——光谱联用 色谱——色谱联用417。