牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白主要抗原区域的高效表达纯化与鉴定
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生物技术
中国畜牧兽医 ２０１３年第４０卷第３期
为模板，进 行 ＰＣＲ 扩 增，ＰＣＲ 反 应 体 系 为 ５０μＬ： ５μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，４μＬ ｄＮＴＰ，引 物 Ｐ１、Ｐ２ 各 １μＬ，ＥｘＴａｑ 酶 １ μＬ，５ μＬ ＤＮＡ，加 水 至５０μＬ。 ＰＣＲ 反应 条 件 为：９５ ℃ 预 变 性 ５ ｍｉｎ；９５ ℃ 变 性 １ｍｉｎ，５８ ℃ 退 火 １ ｍｉｎ，７２ ℃ 延 伸 １ ｍｉｎ，３５ 个 循 环；７２ ℃延伸１０ｍｉｎ，４ ℃终止。 １．２．４ 构建ｇＤ 基因原核表达载体 将 ＰＣＲ 扩增 产物在１０ｇ／Ｌ 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 后，利 用 ＤＮＡ 多功能胶回收试剂 盒 回 收 目 的 基 因 片 段，将 回 收 纯
关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；ｇＤ 蛋白；原核表达；鉴定 中 图 分 类 号 ：Ｑ７８ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１６７１－７２３６（２０１３）０３－００７７－０３
牛 传 染 性 鼻 气 管 炎 （ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａ－ ｃｈｅｉｔｉｓ，ＩＢＲ）又 称 “牛 病 毒 性 鼻 气 管 炎 ”（ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ，ＢＶＲ）、“坏 死 性 鼻 炎 ”（ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｒｈｉ－ ｎｉｔｉｓ，ＮＲ）、“红 鼻 病 ”（ｒｅｄ ｎｏｓｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＮＤ），由 牛 传染 性 鼻 气 管 炎 病 毒 （ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａ－ ｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＩＢＲＶ）引 起 （Ｇｉｂｂｓ 等，１９９７；滕 英 娟 等，２０１１）。该病呈 世 界 性 分 布，世 界 动 物 卫 生 组 织 将其列为 Ｂ 类动物传染病，每年都给全球的养牛 业 带来十分巨大的经济损 失（Ｃｏｗｌｅｙ等，２０１１；Ｏｌｉｖｅｉ－ ｒａ等，２０１１；Ｃｒｏｏｋ 等，２０１２）。 中 国 大 陆 于 １９８１ 年 从新 西 兰 进 口 奶 牛 中 分 离 到 ＩＢＲＶ （周 泰 冲 等， １９８１），目 前 该 病 毒 是 中 国 进 出 境 动 物 的 重 点 检 疫 对 象（邹 世 颖 等，２０１２）。ＩＢＲＶ 又 称 牛 疱 疹 病 毒 １ 型 （ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １，ＢＨＶ－１），属 于 疱 疹 病 毒 科 （Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）α疱疹 病 毒 亚 科 （ａｌｐｈａ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉ－ ｎａｅ）水 痘 病 毒 属 （Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（Ｓｃｈｗｙｚｅｒ 等， １９９６；霍志 云 等，２０１２；郭 利 等，２０１２）。ＩＢＲＶ 基 因 组编码１１ 种糖蛋白，其中 ｇＤ 糖蛋白是ＩＢＲＶ 的 主 要结构蛋白，在病毒 吸 附 和 侵 入 宿 主 细 胞 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 ，为 病 毒 复 制 的 必 需 基 因 ，同 时 诱 导 体 液 免疫和细胞免疫，是ＩＢＲＶ 的主要免疫原性蛋白，是 ＩＢＲ 诊断试剂 和 亚 单 位 疫 苗 研 制 的 首 选 蛋 白 （Ｐｅｒ－ ａｌｔａ等，２００７；Ｖａｓｉｌｅｎｋｏ 等，２０１２；Ｒｕｉｚ 等，２０１２）。 鉴于此，本研 究 对 ｇＤ 蛋 白 主 要 抗 原 区 域 进 行 了 原 核 表 达 ，并 对 表 达 蛋 白 进 行 了 纯 化 和 活 性 鉴 定 ，旨 在 为开发ＩＢＲ 诊断试剂盒奠定基础，为ＩＢＲ 的预防及
切 ；２，ｐＥＴ３０ａＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ 。
２．３ ｐＥＴ－ｇＤ 重组蛋白的高 效 表 达 由 图 ３ 可 知， ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电 泳 分 析 结 果 显 示，ｇＤ 蛋 白 在 ＢＬ２１ （ＤＥ３）中得到 了 高 效 表 达，表 达 蛋 白 分 子 质 量 约 为 ４０ｋｕ，与 预 期 大 小 相 符 。
化 的 基 因 片 段 与 ｐＥＴ－３０ａ 原 核 表 达 载 体 分 别 用 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ双酶切于３７ ℃作用４ｈ，胶回收 酶切后的基因片段用 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶于 ２２ ℃ 连接 ８ｈ，取连接产物 转 化 ＤＨ５α 感 受 态 细 胞，用 质 粒 提 取试剂盒 提 取 重 组 质 粒，经 ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ 双 酶 切鉴定正确后，送生 工 生 物 工 程 （上 海）有 限 公 司 进 行序列测定。
２ 结 果 与 分 析 ２．１ ＰＣＲ 扩增结 果 ＰＣＲ 扩 增 产 物 在 １０ｇ／Ｌ 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 ，约 ８４６ｂｐ 处 可 见 明 显 的 基 因 片 段 （图 １），与 试 验 的 预 期 大 小 相 符 。 ２．２ ｐＥＴ－ｇＤ 表 达 载 体 的 鉴 定 构 建 的 ｐＥＴ－ｇＤ 重组表达载体经 ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切可以切出
图 ４ 表 达 产 物 的 免 疫 印 迹 分 析 注：１，纯 化 蛋 白 与 ＩＢＲＶ 阳 性 血 清 作 用；２，空 载 体 表 达 菌 与
ＩＢＲＶ 阳性血清 作 用；３，纯 化 蛋 白 与 ＩＢＲＶ 阴 性 血 清 作 用； ４，空载体表达菌与ＩＢＲＶ 阴性血清作用。
图３ 纯化蛋白的 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 注：Ｍ，标准蛋 白 质 Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐＥＴ３０ａ 诱 导 表 达 产 物；２，ｐＥＴ－
ｇＤ 诱导 表 达 产 物；３，超 声 破 碎 后 沉 淀；４，超 声 破 碎 后 上 清； ５，纯 化 蛋 白 。
２．４ ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 蛋 白 的 纯 化 图 ３ 可 知，ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳分析结果显示，ｇＤ 蛋白主要在细胞破 碎
１．２．５ ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 蛋 白 的 诱 导 表 达 将 酶 切 及 序列 测 定 均 正 确 的 ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 质 粒 转 化 ＢＬ２１ （ＤＥ３）感 受 态 细 胞，同 时 设 ｐＥＴ－３０ａ 空 载 体 转 化 ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细 胞 做 对 照，挑 取 单 菌 落 过 夜 增 菌，次日 以 １∶１００ 比 例 增 菌 至 Ｄ６００ｎｍ 为 ０．６～０．７ 时，加入ＩＰＴＧ 使 其 终 浓 度 为 １．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，继 续 培 养５ｈ，经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳分析表达情况。 １．２．６ ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 蛋 白 的 纯 化 将 已 鉴 定 表 达 的诱导菌液以 ５０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ ｍｉｎ，收 集 菌 体， ＰＢＳ洗 涤 ２ 次 后，采 用 超 声 波 破 碎 细 胞，破 碎 后 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ２０ ｍｉｎ，同 时 取 上 清 与 沉 淀 进 行 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳分 析 目 的 蛋 白 在 细 菌 中 的 存 在 形 式。对重组蛋白采 用 镍 离 子 亲 和 层 析 法 纯 化，ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳检测纯化蛋白的纯度。 １．２．７ ｐＥＴ－ｇＤ 重组蛋白的 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ活性 检测 取 ｐＥＴ－３０ａ空 载 体 表 达 菌、重 组 ｇＤ 纯 化 蛋 白经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电 泳 后，转 印 至 硝 酸 纤 维 素 膜，经 ５％脱脂奶粉封闭 ２ｈ 后，分 别 加 入 １∶１００ 稀 释 的 ＩＢＲＶ 阳性血清和ＩＢＲＶ 阴性血清于３７ ℃作用１ｈ， 加入１∶５０００倍稀释 ＨＲＰ 标记兔 抗 牛ＩｇＧ 抗 体 于 ３７ ℃作用１ｈ，在 二 氨 基 联 苯 胺 （ＤＡＢ）缓 冲 溶 液 中 显 色 ，纯 化 水 冲 洗 终 止 反 应 。
约８４６ｂｐ的目的片段（图 ２），测 序 结 ＰＣＲ 扩增结果 注：Ｍ，ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，ｇＤ ＰＣＲ 扩 增 结 果；２，阴 性
对照。
图 ２ 重 组 表 达 载 体 酶 切 鉴 定 注：Ｍ，ＤＬ１５０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐＥＴ－ｇＤ ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ 酶
收 稿 日 期 ：２０１２－０８－２２ 作 者 简 介 ：乃 德 合 （１９７１－ ），男 ，青 海 人 ，兽 医 师 ，研 究 方 向 ：传 染
病防治。
控制提供技术支持。 １ 材 料 与 方 法 １．１ 材 料 １．１．１ 菌 （毒 ）种 与 血 清 ＤＨ５α 菌 种 、ＢＬ２１（ＤＥ３） 菌种、ｐＥＴ－３０ａ原核 表 达 载 体 均 由 青 海 省 动 物 疾 病 中心实验室 保 存；ＩＢＲＶ（ＢａｒｔｈａＮｕ／６７ 株）及ＩＢＲＶ 阳 性 、阴 性 血 清 均 购 自 中 国 兽 医 药 品 监 察 所 。 １．１．２ 试 剂 ＥｘＴａｑ、ＢａｍＨⅠ 和 ＨｉｎｄⅢ 限 制 性 内切酶、Ｔ４ 连 接 酶、低 分 子 质 量 蛋 白 质 Ｍａｒｋｅｒ均 购自宝生物（大连）工程有限公司；病毒基因组 ＤＮＡ 快速提取试剂盒购 自 北 京 某 生 物 科 技 有 限 公 司；预 染低分子质量蛋白质 Ｍａｒｋｅｒ购自北京索莱宝科 技 有限公司；ＤＮＡ 多功能胶回收试剂盒与质粒提取试 剂盒购自北京百泰 克 生 物 科 技 有 限 公 司；辣 根 过 氧 化物酶（ＨＲＰ）标记兔抗牛ＩｇＧ 购自 Ｓｉｇｍａ公司。 １．２ 方 法 １．２．１ 引 物 设 计 与 合 成 根 据 ＧｅｎＢａｎｋ 公 布 的 ＩＢＲＶ（ＢａｒｔｈａＮｕ／６７ 株 ）基 因 组 序 列，用 ＤＮＡＳｔａｒ 生物学软件分析 ｇＤ 基 因 的 抗 原 区 域 与 亲 水 区，设 计合成１对针对 ｇＤ 蛋白主 要 抗 原 区 域 的 特 异 性 引 物 ，Ｐ１：５′－ＣＣＧＧＧＡＴ－ＣＣＣＣＧＡＴＧＣＣＧＣＧＡＴＡＣ－ ＡＡＣＴＡ－３′；Ｐ２：５′－ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧ－ ＧＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＣ－３′（下 划 线 部 分 表 示 引 入 的 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ酶切位点）。引物送生工生物工 程 （上 海 ）有 限 公 司 合 成 。 １．２．２ 提 取 ＩＢＲＶ 基 因 组 ＤＮＡ 按 病 毒 基 因 组 ＤＮＡ 快 速 提 取 试 剂 盒 提 取 ＩＢＲＶ 基 因 组 ＤＮＡ， －２０ ℃保存。 １．２．３ ＰＣＲ 扩增 ｇＤ 基因 以提取的ＩＢＲＶ ＤＮＡ
中国畜牧兽医 ２０１３年第４０卷第３期
生物技术
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牛传染性鼻气管炎病毒ｇＤ 蛋白主要抗原区域的 高效表达、纯化与鉴定
牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用
和试 验 相 比较 ，符合 率 、敏 感性 和 特异 性 分别 为 ８ ． ％、８ ． ４１ ５０％和 ８ ． ３４％。应 用该诊 断方 法和本 实验 室 已建 立的
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第３ ０卷 第 ７期
２０ 年 ０８ ７ 月
中 国 预
防
兽
医
学 报
Ｖ ｏ ．０． ｏ． １３ Ｎ ７
Ｊ ． ２ ｕ１ ９
Ｃｈｉｅ ｅＪ ｕｒ ａ ｆＰｒ ｖ ｎ ｉ ｅｅ ｎａｙ Ｍ ｅ ｉｉ ｅ ｎ ｓ ｏ ｎ ｌｏ ｅ ｅ ｔｖｅＶ ｔｒ ｒｇ 白 Ｄ 间接 Ｅ ＩＡ 方 法 的建 立及 应 ＬＳ
祖 立 闯 １，朱远 茂 ，王 延辉 ，辛 九庆 ，李 娇 ，任 宪刚 ，冯 军科 ，薛 飞 ， ２
（ 中国农 业科学院 哈尔滨兽 医研究 所 兽 医生物技 术国 家重点实验 室 ／ １ 大动物传 染病研 究室 ，黑 龙江 哈尔滨 １０ ０ ５０１
ｉｆ ｔ ｕ ｏ ｉ ｉｏ ａｈ ｉｓ ｉ ｓ ＩＲ ） ｘｒｓ ｄｉ Ｅｃｌａ ｏｔ ｇａ ｔ ｅ， ｅｉ ａ ｄａ Ｄ Ｅ ＩＡ． ｈ ｃｍ ｉａｔ Ｄ ｎｅ ｉ ｓ ｖｎ ｒ ｎ ｔ ｃ ｅｉ ｖ ｕ （ Ｖ ｅｐｅｓ ．ｏ ｃａｉ ｎｉ ｎ ｄ ｓ ｎ ｔ ｓ — ＬＳ Ｔ ｅｒ ｏ ｂｎｎ ｃｏ ｂ ｅｈ ｒ ｔ ｒ Ｂ ｅ ｎ ｉｓ ｎ ｇ ｇ ｅ ｇ ｅ ｇ
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山东地区牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定
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（ １ ． 山东省农业科学院奶牛研 究中心 ， 山东 济南
摘
２ ５ ０ １ ３ １ ； ２ ． 山东省农 业科学院家禽研究所 ， 山东 济南
２ ５ ０ ０ ２ ３ ）
要： 从 山东某地 区发生 呼 吸道 症状 的奶 牛场 中采集 样 品， 按 常规 方法 处理 后 ， 接 种 牛 肾细胞 （ ＭＤ —
ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ． Ｔ ｈ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｗ ａ ｓ ｃ ｏ ｎ ｆ ｏ ｍｅ ｒ ｄ ａ ｓ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ ｂ ｏ ｖ ｉ ｎ ｅ ｒ ｈ ｉ ｎ ｏ ｔ ｒ ａ ｃ ｈ ｅ ｉ ｔ ｉ ｓ ｖ ｉ ｕｓ（ ｒ Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ）ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ Ｄ Ｎ Ａ
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牛传染性鼻气管炎病毒检测方法研究进展
中国动物保健2020.03疾病防治牛传染性鼻气管炎病毒检测方法研究进展刘清荣（山东省诸城市畜牧业发展中心山东潍坊262200）牛传染性鼻气管炎病毒属于疱疹病毒I 型，病牛和带毒牛是主要传染源，牛传染性鼻气管炎病毒可以发生呼吸道和生殖道传播，病毒通过胎盘可以发生垂直传播。
此外，病毒可传染性鼻气管炎病毒是牛易感的病毒性传染病，以呼吸道症状为主，是一种急性、热性、接触性传染病。
近年来，牛传染性鼻气管炎病毒的发病呈上升趋势，对养牛产业危害较大，加强牛传染性鼻气管炎病毒的实验室检测对预防和控制本病起到关键作用，本文主要综述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法研究进展，为相关疾病的诊断及防控提供参考。
传染性鼻气管炎病毒；检测方法；研究进展以在体内潜伏在腰、脊神经节或三叉神经节内，带毒牛呈潜伏感染状态，可以长期带毒。
不同年龄和性别的牛都可以感染病毒，病牛主要临床表现为鼻气管炎、脑膜脑炎，孕牛流产，产死胎，子宫内膜炎和乳房炎，肠炎等，牛传染性鼻气管炎病毒危害巨大，只有加强牛传染性鼻气管炎病毒的实验室检测才能有助于疾病的早期诊断和防治，牛传染性鼻气管炎病毒的实验室检测方法主要有下面几种。
1PCR 检测方法PCR 方法是最常用的分子生物学技术，通过设计特异性检测引物实现核酸片段的体外扩增，是动物疾病检测特异、敏感、准确的检测方法。
徐娜等[1]建立了牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR 检测方法，该方法根据GenBank 中公布的牛传染性鼻气管炎病毒gE 和gB 基因序列设计2对特异性检测引物，预期扩增片段大小分别为112和78bp ，该检测方法特异性强，对牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛和羊布鲁菌检测结果均为阴性，gB 引物最低检测浓度为2.3×103拷贝/μL ，gE 引物最低检测浓度为2.4×103拷贝/μL ，该检测方法重复性好，可以用于牛传染性鼻气管炎病毒野毒株感染和gE 基因缺失疫苗株的鉴别诊断。
牛传染性鼻气管炎病毒DQ株gD基因表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用
ｃ ｍｂｉ ａ ｐ ｏ ｅｎｓ Ｔｈｒ ｕｇ ｔ ｍ ａ ｒｘ ｘ ｒｍ ｅ ｔ ｏ ｎ ｎｔ ｒ ｔ ｉ ． ｏ ｈ ｈｅ ｔ ｉ ｅ ｐｅ ｉ ｎ ｓ， ｔ ｏｐ ｉ ｌ ｏａ ｉ ａ ｔｇ ｎ ｏ ｅ ｒ ｔｏ ｗａ ｈｅ ｔｍａ ｃ ｔｎｇ ｎ ｉ ｅ ｃ ｎｃ ｎｔ ａ ｉ ｎ ｓ
ｂｏ ｉ ｇ ｗ ａ ：５ ０ ． ｎ ｃ ｍ ｐ ｒｓ ｎ ｔ ｈ Ｎ ｅ ｔａ ｄ ｔ ｅ ｗ ｈｏ ｅ ｖ ｒ ｖ ｎｅ Ｉ Ｇ ｓ１ ００ Ｉ ｏ ａ ｉ ｏ ｏ ｔ ｅ Ｖ Ｔ ｓ ｎ ｈ ｌ ｉｕｓＥＬＩ Ａ ，ｔ ｅ ａ ｒ ｅ ｅ ｔｒ ｔ Ｓ ｈ ｇ ｅ ｍ ｎ ａ ｅｏｆ
法 。构 建 ｐ Ｔ３ ａｇ Ｅ ０ — Ｄ重 组 质 粒 ， 大 肠 杆 菌 中表 达 Ｉ Ｒ 重 组 ｇ 蛋 白 ， ｓｅｎ ｂｏ 检 测 该 重 组 蛋 白具 有 良好 的 免 疫 活 性 。 在 Ｂ Ｖ Ｄ Ｗｅ ｔｒ — ｌｔ
通 过方 阵试 验确 定 了 抗 原 的 最 适 包 被 浓 度 为 ２ ５￣ ／ 血 清 最 佳 稀 释 倍 数 为 １： ０ ， ． ｇ ｍＩ， ２ ０ 酶标 二 抗 最 佳 稀 释 倍 数 为 １： ０ ， ５０ ０
牛传染性鼻气管炎病毒部分gB蛋白的原核表达及抗原性分析
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［７］ＳｔｕｄｉｅｒＦＷ．Ｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙａｕｔｏ－ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｓｈａｋｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００５，４１（１）：２０７－２３４．［８］中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典（三部）［Ｓ］．北京：中国农业出版社，２０１６：４４－４９．［９］陈 理，俞昌喜．重组大肠杆菌高密度发酵工艺进展［Ｊ］．海峡药学，２０１１，２３（３）：１５－１８．［１０］张建新，张 吨，胡文波，等．重组大肠杆菌高细胞密度发酵研究进展［Ｊ］．中国酿造，２０１１，２２７（２）：５－８．［１１］Ａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔｈｅａｌｔｈｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｓｅｒｖｉｃｅ，ＵＳＤＡ．９ＣＦＲＣｈ．Ｉ（１－１－０７Ｅｄｉｔｉｏｎ）［Ｍ］．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｕ．Ｓ．ＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔＰｒｉｎｔｉｎｇＯｆｆｉｃｅ，２００７：６８８－６９８．［１２］Ｂｒｉｔｉｓｈｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）［Ｍ］．Ｌｏｎｄｏｎ：ｔｈｅＳｔａｔｉｏｎｅｒｙＯｆｆｉｃｅ，２００５：１９２－１９９．何小丽，李凡飞，王文佳，等．牛传染性鼻气管炎病毒部分ｇＢ蛋白的原核表达及抗原性分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（１７）：１８９－１９２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．１７．０４７牛传染性鼻气管炎病毒部分ｇＢ蛋白的原核表达及抗原性分析何小丽，李凡飞，王文佳，张 凯，程 成，许立华（宁夏大学农学院，宁夏银川７５００２１） 摘要：为对牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因进行原核表达，并对表达产物进行抗原性分析，利用笔者所在实验室已构建好的ｇＢ－ＢＬ２１重组阳性菌落，进行异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达，并对培养及诱导表达条件（ＩＰＴＧ最佳浓度、作用时间）等影响表达的因素进行优化，然后将表达的ｇＢ重组蛋白进行亲和层析纯化。
牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA的建立与应用的开题报告
牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA的建立与
应用的开题报告
根据国内外文献资料可知，牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）是一种致牛呼吸系统疾病的病毒。
为了有效地预防和控制IBRV的发生，需要建立一种精确、灵敏、特异性高的检测方法。
重组gD蛋白是IBRV病毒侵染宿主细胞的关键蛋白，具有良好的特异性。
因此，利用重组gD蛋白建立间接ELISA检测方法，已成为IBRV的研究热点之一。
本研究旨在建立一种牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA检测方法，并应用于实验室的检测中。
具体包括以下内容：
1.采集牛血清样本，利用重组gD蛋白制备IBRV特异性抗体。
2.利用SDS-PAGE和Western blot方法对重组gD蛋白进行检测，确保其纯度和
特异性。
3.优化重组gD蛋白的涂布浓度、血清稀释倍数、探针抗体浓度等实验条件，建
立牛IBRV重组gD蛋白间接ELISA检测方法。
4.对建立的重组gD蛋白间接ELISA检测方法进行评估，包括检测范围、检测灵
敏度、特异性和稳定性等指标。
5.应用该检测方法对野外牛群进行IBRV感染情况调查，并与实时荧光定量PCR
方法进行比对，评估其在牛IBRV检测中的实际应用价值。
通过本研究的开展，将建立一种牛IBRV重组gD蛋白间接ELISA检测方法，为
该病防控提供新的手段和方法。
同时，将对该检测方法的灵敏度、特异性、稳定性和
实际应用价值进行评估，为其在牛IBRV检测中的推广应用提供参考。
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测
增ｇ Ｄ基因 ９３ ｐ ４ 的片段 ，将 目的片段定向克隆到 ｐ Ｔ ０ 表 达载体 中，酶切及测序鉴定均正确后 ，转化 Ｂ ２ 表 ｂ Ｅ ３ａ Ｌ１
达 茵 ，经 Ｉ Ｔ 诱 导 得 到 部 分 可 溶 表 达 的 重 组 蛋 白。 用 Ｎｉ 亲 和 层 析 法 在 非 变性 的 条 件 下 纯 化 重 组 蛋 白 ， 纯化 ＰＧ 柱 的 重组 蛋 白浓度 为 ０８ ２ｍｇ ５ ／ ｍＬ，纯度 为 ８ ． ５２％。Ｗｅｔｒ ｌｔ ｓ ｎｂｏ 、间接 Ｅ ＩＡ检 测证 明 纯化 的 重 组 蛋 白 具有 良好 的 ｅ ＬＳ
（ ａｉｎ ｌ ｙ Ｌ ｂ ｒｔｒ ｆ ｔｒ ａｙ Ｂ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ Ｈａｂｎ Ｖｅ ｒ ａｙ Ｒ ｓ ａｃ ｓ ｔｔ ， Ｎ ｔ ａ Ｋｅ ａ ｏ ａ ｙ ｏ ｅ ｎ ｒ ｉｔｃ ｎ ｌｇ ， ｒ ｉ ｔｉ ｒ ｅｅ ｒｈ Ｉ ｔ ｕｅ ｏ ｏ Ｖｅ ｉ ｅｎ ｎ ｉ
抗 原性 和 特 异性 。
关键 词 ：牛传 染性 鼻 气 管 炎病 毒 ；ｇ Ｄ糖 蛋 白 ；原 核 表 达 ；活性 检 测 中图分 类 号 ：￥ ５ ． ８２６ ５ 文 献标 识 码 ：Ａ 文 章编 号 ： １０．５９２ ０ ）１ ８５０ ０ ８ ８（０ ７ｌ－ ６ ．５ ０ ０
Ｃｈ ｒ ｃｅｒ ａ ｉｎ ｏ ｒ ｎ ａ ｅ ｌｃ ｐ ｏ ｅ ｎ Ｄ ｏ ｆ ｃｉｕ ａ ａ ｔ ｉ ｔ ｆｔｕ ｃ ｔ ｄ ｇｙ ｏ ｒ ｔ ｉ ｆｉ ｅ ｔ ｓ ｚ ｏ ｎ ｏ
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表位鉴定
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表位鉴定周跃辉;朱远茂;任建乐;严昊;王雪枝;马磊;史鸿飞;萨飞【摘要】为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(1BRV) gD蛋白抗原表位,本研究利用pET-30a原核表达系统表达、纯化了重组gD蛋白,采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,取脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,以重组gD蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗gD蛋白的MAb杂交瘤细胞株(1G3).间接免疫荧光结果表明:MAb与IBRV呈阳性反应,中和试验测定其腹水中和效价为1:32.利用肽扫描技术原核表达GST融合短肽对MAb 1G3识别的抗原表位进行筛选鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为259EESKGYE265.蛋白序列分析表明该抗原表位在IBRV各分离株及牛疱疹病毒5型(BoHV-5)中均保守.本研究为IBRV 的糖蛋白gD的结构和免疫学特性及IBRV致病性的深入研究奠定了基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2015(037)011【总页数】5页(P871-874,898)【关键词】牛传染性鼻气管炎病毒;gD蛋白;单克隆抗体;表位鉴定【作者】周跃辉;朱远茂;任建乐;严昊;王雪枝;马磊;史鸿飞;萨飞【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由IBR 病毒(IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎和上呼吸道炎症为主要特征[1]。
传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化
传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化王欣;王琦;齐晓雪;毕莹;倪宏波【摘要】[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)035【总页数】3页(P231-233)【关键词】IBR;gD;表达;纯化;亚单位疫苗【作者】王欣;王琦;齐晓雪;毕莹;倪宏波【作者单位】黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆163319【正文语种】中文【中图分类】S858.23牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)可引起牛发生急性、热性、接触性传染病——牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)[1]，主要表现为呼吸道和生殖道感染[2-3]。
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的原核表达及其免疫原性
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的原核表达及其免疫原性丁国伟;李琛;李玉安;叶正琴;宋庆庆【摘要】The expression and immunogenicity of conserved domain of protein gD were researched for developing antibody detection kit of IBRV virus. Specific primers were designed for the amplification of the gene gD sequence with the immunoglobulin-like domain based on the full length gene gD sequence from bovine herpesvirus, type 1 (GenBank ID NO.NC_001847). The immunoglobulin-like domain gene of gD protein was inserted into plasmid pET-32a after PCR amplication, and was named as pET32a-ΔgD. The expression vector was then transferred into strain E. coli Rosseta (DE3) with aim to induce the recombinant protein. The result showed that 43000 recombinant proteins were obtained through the analysis of SDS-PAGE, and the relative molecular mass of them were accordance with the theoretical value of recombinant protein gD. After purified from nickel column, the concentration of them was 2.5 mg/mL, with the purity of about 95％. The recombinant proteins were proved of good immunogenicity after experienced the identification of Western Blot and Elisa, which indicated that they could be used as antigen for the development of antibody detection kit of IBR.%为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究.根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(GenBank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a-ΔgD,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达.经SDS-PAGE分析,获得了相对分子质量约43000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD融合蛋白的理论相对分子质量一致.经镍柱纯化后,重组蛋白的质量浓度为2.5 mg/mL,纯度约为95％,Western Blot及ELISA鉴定结果显示该重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,可用于IBRV抗体检测试剂盒的开发.【期刊名称】《湖南农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(044)001【总页数】5页(P77-81)【关键词】牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV);gD蛋白;原核表达;免疫原性【作者】丁国伟;李琛;李玉安;叶正琴;宋庆庆【作者单位】扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州 225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州 225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州 225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州 225008;扬州优邦生物药品有限公司,江苏扬州225008【正文语种】中文【中图分类】S852.6牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)又称牛疱疹病毒I型(bovine herpesvirus 1，BHV–1)，属疱疹病毒科疱疹病毒亚科水痘病毒属[1]。