酵母双杂交实验 教案
蛋白的酵母双杂交操作手册
蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分 系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。
在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。
一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。
在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。
GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交.三杂交
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成， 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
negative selection by adding FOA)
酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
酵母双杂交实验 教案
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、实验目的掌握酵母双杂交原理和方法。
二、实验原理酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）和转录激活结构域（activation domain, AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
根据转录因子的这一特性，将BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合，构建出BD-X质粒载体；将AD 基因与cDNA 文库，基因片段或基因突变体（以Y表）融合，构建AD-Y质粒载体。
两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。
蛋白质X 和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因（如ADE2，HIS3，MEL1或 LacZ）等的表达，使转化体由于HIS3 或LEU2 表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ 表达而在X-Gal 存在下显蓝色。
图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。
酵母双杂交实验报告
酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。
本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。
转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。
在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。
如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。
三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。
设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。
2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。
酵母双杂交实验设计
酵母双杂交实验设计
1.实验目的：
本实验旨在研究不同基因型酵母的双杂交反应，以探索酵母双杂交的机制。
2.实验材料：
（1）酵母菌：不同基因型的酵母菌；
（2）培养基：YPD培养基；
（3）实验设备：培养箱、显微镜、离心机、超声波消毒器、混合器等。
3.实验步骤：
（1）将不同基因型的酵母菌分别放入YPD培养基中，在培养箱中培养，直到藻体膨大为止；
（2）将培养基中的酵母菌放入离心机中，进行离心，分离出酵母菌藻体；
（3）将分离出的酵母藻体放入超声波消毒器中，进行消毒；
（4）将消毒后的酵母藻体放入混合器中，混合后，放入YPD 培养基中，再放入培养箱中，培养；
（5）在培养过程中，定期使用显微镜观察培养基中的变化，以观察双杂交反应的情况。
4.实验结果：
通过实验，可以获得不同基因型酵母双杂交反应的结果，从而探索酵母双杂交的机制。
酵母双杂交
酵母双杂交（筛库）pGBK-gene 转化酵母1.酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。
2.挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。
3.次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测定OD600，直至OD600达到0.5左右。
4.（超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm离心5min。
5.弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。
6.弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。
7.弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。
8.取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。
9.加入280μl PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。
10.42°C热激10min，立即放冰上2min。
11.室温下6000-8000rpm离心20~30s，去上清。
12.重悬于500μl无菌水中，取100-200μl涂在SD-trp板上，30°C烘箱培养48-72h。
酵母大规模转化AD文库1.挑取上述SD-trp板上的pGBK连的基因转化子，YPDA培养基中培养至饱和。
2.将上述转化子转接至200mlYPDA培养基中，30°C培养至OD600 0.5-0.6左右。
3.离心收集菌体，20ml无菌水洗涤，3000rpm离心5min。
4.去上清，重悬于20ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。
5.去上清，合并菌体于一管，1ml TE/LiAc溶液悬浮菌体。
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酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）
一、实验目的
掌握酵母双杂交原理和方法。
二、实验原理
酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）和转录激活结构域（activation domain, AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
根据转录因子的这一特性，将BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合，构建出BD-X质粒载体；将AD 基因与cDNA 文库，基因片段或基因突变体（以Y表）融合，构建AD-Y质粒载体。
两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。
蛋白质X 和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因（如ADE2，HIS3，MEL1或 LacZ）等的表达，使转化体由于HIS3 或LEU2 表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ 表达而在X-Gal 存在下显蓝色。
图 1-1 酵母双杂交基本原理
酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。
(2)用已知功能的蛋白做诱饵，在cDNA文库中寻找有相互作用的未知蛋白，以获取蛋白质相互作用的网络途径信息。
(3)以功能未知的新蛋白去筛选文库，根据选到的靶蛋白的已知功能来推测该新蛋白的功能。
(4)建立蛋白质相互作用的图谱。
使用酵母双杂交系统应注意如下问题：(1) 在筛选文库之前，要检测诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因。
(2)由于诱饵蛋白的存在致使报告基因His产生渗漏表达（leaky）。
一般情况下，在培养基中加入3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）可以有效地抑止His报告基因的渗漏表达。
(3)在完成筛选之后，需检测猎物蛋白是否自激活。
一个完整的利用酵母双杂交筛选相互作用蛋白的实验包括cDNA文库的构建，诱饵基因载体构建，载体
转化酵母，报告基因渗漏表达滴定，酵母接合实验，报告基因表型的测定，诱饵蛋白与靶蛋白相互作用复验。
本实验只完成酵母接合实验，报告基因表型的测定。
在本实验中，pDEST32质粒携带诱饵蛋白MED25，营养标记基因是Leu2，转化到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH109（Mata，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4△，gal80△，LYS2::GAL1UAS- GAL1TATA- HIS3，GAL2UAS- GAL2TATA- ADE2，URA3::MEL1UAS- MEL1TATA- lacZ，MEL1）菌株中；pDEST22质粒携带的靶蛋白文库来自拟南芥转录因子，营养标记基因是Trp1，转化到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y187（MATα ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901,leu2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, MEL1,URA3::GAL1UAS - GAL1TATA-lacZ）菌株中。
报告基因使用HIS3。
诱饵载体和猎物载体的启动子都是酵母组成型强启动子ADH。
其中，拟南芥转录因子库是组分特异的库（specific libraries），相对传统全cDNA库而言，它不受组分的组织表达特异性、发育阶段特异性以及表达量低的影响，提高了筛选效率。
该库由1000多个独立的克隆组成，筛选后不需测序。
图1-2 实验材料示意
三、材料、试剂、仪器
1.材料
酵母菌株AH109含有pDEST32-bait 质粒(Leu )
酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22- prey质粒(Trp)，共有4个不同基因
酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22空质粒(Trp)
2.试剂
液体YPAD培养基30ml
液体SD-Trp培养基30ml
液体SD-Leu培养基5ml
固体SD-Trp-Leu培养基30ml
固体体SD-Trp-Leu-His培养基30ml
灭菌水30ml
如上培养基需121℃灭菌15分钟。
3.仪器
30℃的恒温摇床，30℃的恒温培养箱，电子天平，pH计；量筒（10ml，100ml），烧杯（50ml，100ml），玻璃棒，1000ul移液器, 200ul移液器, 20ul移液器。
灭菌的1000ul、200ul吸头，灭菌的10ml 试管，灭菌的1.5ml离心管，灭菌平皿。
四、操作
1.实验准备
灭菌：各种培养基，蒸馏水约30ml，10ml试管约10支， 1.5ml离心管约20个，200ul和1000ul吸头各半盒。
2.培养酵母
1)挑酵母诱饵蛋白单菌落，以3ml SD-Trp培养基培养过夜。
培养条件：30℃，200rpm。
2)选含AD 蛋白单菌落，分别以3ml SD-Leu培养基培养过夜。
培养条件：30℃，200rpm。
3)挑酵母AD阴性对照单菌落，以3ml SD-Trp培养基培养过夜。
培养条件：30℃，200rpm。
3.酵母接合
在4个新试管中分别加入2.8ml YPAD培养基，各加100ul诱饵蛋白的菌液，再分别加入100ul各靶蛋白及对照的菌液，混匀，30℃，200rpm培养16-24小时。
4.在筛选培养基上培养接合后的酵母
取酵母菌液，用灭菌水稀释到1/10，点到筛选培养基SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade平板上，每个点5ul。
5.观察实验结果
2-4观察实验结果
五、实验提示
1.如果诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能激活报告基因，可以用什么方法继续寻找与之相互作用
的蛋白？。