生物工程导论

第一章绪论生物工程是生命科学和工程科学的交叉科学。

生物工程学科的任务是促进和实现生命科学的实验室研究成果向应用领域的转化。

1.1生物工程的学科基础以生物科学和生物技术为基础，结合化学工程、机械工程、控制工程、环境工程等工程学科，研究和发展利用生物体系或其中的一部分生产有益于社会的产品或达到一定社会目标的过程工程科学。

生物工程的研究对象包括活的生物体或它们的一部分。

生物工程的任务就是为细胞的生长和目标产物积累创造最好的条件，研究开发最适合的工艺路线和设备，实现工业化生产以满足社会需要。

1.2生物工程的研究领域生物工程的研究领域包括：基因工程、细胞工程、酶工程、微生物工程（发酵工程）及生物分离工程。

1.2.1基因工程DNA是遗传的物质基础，1967年第一个基因工程产品——人胰岛素通过定位突变的方法使所表达的蛋白质产物的结构和功能发生变化，根据需要设计新的蛋白质氨基酸序列，已经发展成为一门新的交叉学科——蛋白质工程。

1.2.2细胞工程细胞是构成包括人类、动物、植物和微生物在内的几乎所有生物的基本单元。

哺乳动物的干细胞（即未分化的细胞）也具有全能性和无限繁殖的能力。

发酵工程和生物分离技术的进步则是提高细胞培养工程和目标产物回收过程效率的可靠保障。

1.2.3酶工程几乎所有的酶都是蛋白质，酶又具有催化剂的功能，即能够降低化学反应的活化能、加快反应速率，在反应中不消耗，反应结束时恢复到原来的状态。

酶工程是研究酶的分离、提纯及利用酶作为生物催化剂，实现化学转化，合成各种产物或达到人类所需社会目标的工程科学。

酶催化反应的特点是很高的效率和专一性1.2.4发酵工程发酵工程已经泛指所有细胞（动物、植物、微生物及基因工程细胞）的大规模培养并获得目标产物的过程。

1.2.5生物分离工程与其他分离过程类似，生物技术产品的分离方法也是根据被分离对象及主要杂质的物理化学性质设计分离提纯流程，但是生物技术产品的分离也具有其特殊性，主要表现：(1)目标产物的浓度低（2）目标产物和杂质的物理和化学性质十分接近，而且成分非常复杂（3）目标产物往往具有生物活性（4）在许多应用领域，生物技术产品有很高的纯度和安全性要求。

第二章基因工程2.1概述2.1.1基因工程的诞生基因工程的诞生于1973年2.1.1.1理论上的三大发现（1）20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA 1934年Avery（2）20世纪50年代提出了DNA的双螺旋结构1953年Watson 和Crick提出了DNA的双螺旋结构（3）20世纪60年代确定了遗传信息的传递方式1961年，Monod和Jacob提出每三个核苷酸组成一个密码子，代表一种氨基酸，1966年全部破译了64个密码，叙述了中心法则，提出遗传信息流，即DNA→RNA→蛋白质2.1.1.2技术上的三大发明(1)工具酶限制性核酸内切酶称为“剪刀”,把DNA连接酶比喻成“缝纫针线”(2)载体(3)逆转录酶1970年,Baltimore等人和Temin等人同时在各自的实验室发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。

在完成以上三大理论发现和三大技术发明后，基因工程诞生的条件已经成熟。

1973年，斯坦福大学的Cohen等人进行了另一个体外重组DNA实验并成功地发现了细菌间性状的转移。

这是人类历史上第一次有目的地进行基因重组实验，是第一个实现重组体转化的成功例子，1973年被许多科学家称为基因工程元年。

体外快速扩增技术即聚合酶链式反应（PCR）2.1.2基因工程的内容2.1.2.1基因工程的定义将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体内复制、转录、翻译表达的操作过程称为基因工程。

基因工程的实施至少有四个必要条件：①工具酶②基因③载体④受体细胞基因工程也称为基因克隆或DNA分子克隆2.2基因工程的理论基础2.2.1DNA 的结构与功能基因工程的核心是重组DNA2.2.1.1DNA的组成核苷酸分子中有四种不同的碱基，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）2.2.1.2DNA结构1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构，阐明了DNA 分子的二级结构决定DNA的双螺旋结构的因素有：氢键的形成、碱基的堆积力、磷酸基之间的静电斥力、碱基分子内能的作用等DNA复制有如下特点：①DNA的复制从特定的位点开始，这个位点称为复制起始点，在复制起始点双链DNA解旋，形成复制叉②半保留复制，每一双链体都是由一条亲链和一条新合成的子链组成③DNA的复制具有高度的忠实性④虽然DNA聚合酶是DNA复制的主酶。

然而DNA复制是多种酶和蛋白因子协同有序工作的结果。

DNA解旋酶的功能是在复制叉处使双螺旋DNA解旋2.2.2DNA的变性、复性与杂交在加热或某些试剂的作用下，DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏，双链DNA的多核苷酸链能完全分离，分离过程称为变性或熔解。

当复性的DNA分子由不同的两条单链分子形成时，称为杂交。

2.2.3遗传信息的传递方向——中心法则DNA（基因）→RNA→蛋白质（性状）2.2.3.1RNA的转录转录是基因表达的关键一步，DNA分子中所储存的遗传信息，必须转录成信使RNA才能通过蛋白质生物合成的过程转变成具有生物活性的蛋白质。

2.2.3.2逆转录和逆转录酶以DNA为模板，在RNA聚合酶（依赖于DNA的RNA聚合酶）的催化下合成RNA的过程称为转录，而将以RNA为模板，在逆转录酶（依赖于DNA的RNA聚合酶）催化下合成DNA的过程称为逆转录。

2.2.3.3翻译——蛋白质的生物合成翻译就是将以核苷酸形式编码在mRNA中的信息转变成多肽链中特定的氨基酸顺序。

翻译过程是非常复杂的生物反应过程，需要大约200多种以上的生物大分子参与，包括核糖体、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成酶、各种可溶性的蛋白因子（起始因子、延伸因子、释放因子）等参加并协同作用，从而完成蛋白质的生物合成，体现了生物体的功能基因性状。

2.2.4基因的表达与调控基因根据功能不同分为结构基因、调节基因和操纵基因。

2.3基因工程工具酶基因工程的操作，是分子水平上的操纵，它依赖于一些重要的酶作为工具来对基因进行人工切割和拼接等操作。

一般把这些切割DNA分子、进行DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶。

按用途分：①限制性内切酶②连接酶③修饰酶识别和切割双链DNA分子内特殊核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶，简称限制酶。

其他基因工程的工具酶：DNA聚合酶、逆转录酶、T4多核苷酸酶和碱性磷酸酶等。

2.4基因工程载体2.4.1基因工程载体的定义外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞，这种能承载外源DNA片段（基因）并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体。

2.4.2用于原核生物宿主的载体2.4.2.1质粒载体质粒是能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。

某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。

2.4.2.3柯斯质粒柯斯质粒是将λ噬菌体的粘性末端和大肠菌质粒的抗氨苄西林素基因相连而获得的人工载体,含一个复制起点,一个或多个限制酶切位点、一个cos片段和抗药基因，能加入40 ~50kb的外源DNA，常用于构建真核生物基因组文库。

2.4.4.1Ti质粒2.4.5用于动物宿主的载体2.4.5.1用于昆虫细胞的载体杆状病毒2.4.5.2用于哺乳动物细胞的载体猿猴空泡病毒40（SV40）作为载体2.4.6基因工程载体的必备条件和简单分类必备条件①能够进入宿主细胞②载体可以在宿主细胞中独立复制③要有筛选标记④对多种限制酶有单一或较少的切点,最好是一个切点DNA重组使用的载体分类①克隆载体②穿梭载体③表达载体2.5目的基因的获得基因是具有遗传功能的DNA分子上的片段,平均长度约1000bp。

1975年Sanger等人发明了加减法，能够直接分析100 ~500个核苷酸的DNA片段，取得了DNA测序的重大突破。

基因库也叫基因组文库，是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。

基因文库，也叫cDNA文库，经克隆后形成文库，cDNA文库和基因库的不同在于，cDNA 文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA 重组是直接使用。

2.5.1.2基因组文库的筛选有三种通用的鉴定方法：一是用标记的DNA探针进行DNA杂交；二是用抗体对蛋白质进行免疫杂交：三是对蛋白质的活性进行鉴定。

（1）DNA杂交法双链DNA分子可以分子可以通过热处理或碱变性的方法变性成单链DNA分子。

退火后有的DNA的两条链分别来自不同的DNA 分子，即形成了杂合DNA分子。

（2）免疫反应法若一个目的基因DNA序列可以转录和翻译成蛋白质，那么只要出现这种蛋白质，甚至只需要该蛋白质的一部分，就可以用免疫的方法检测。

（3）酶活性法如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性来筛选目的基因的重组子。

2.5.2真核生物目的基因的获得（cDNA方法、DNA的化学合成法、PCR法）2.5.2.1cDNA方法cDNA文库的组建步骤：①分离表达目的基因的组织或细胞②从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA③合成第一条cDNA链，合成第一条cDNA链需要mRNA作为模板、预先设计的cDNA 合成引物、逆转录酶及4种脱氧核苷三磷酸和相应的缓冲液等④第二条cDNA链合成⑤cDNA的甲基化和接头的加入⑥双链cDNA与载体的连接2.7目的基因导入受体细胞目前用做基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌和枯草杆菌。

最早应用于基因工程，至今仍最广泛使用的受体细胞是大肠杆菌。

大肠杆菌表达产物常常在细胞内形成不溶性包涵体，以不正常的蛋白质折叠形式存在，产物无生物活性。

枯草杆菌主要用于分泌型表达，缺点是表达产物容易被枯草杆菌分泌的蛋白酶水解，而且重组质粒在枯草杆菌中的稳定性较差。

将外源重组子分子导入受体细胞的方法很多，其中转化（转染）和转导主要适用于原核的细菌细胞和低等的真核细胞（酵母），而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。

原核细胞的转化过程就是一个携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞、并在胞内复制和表达的过程。

转化过程包括制备感受态细胞和转化处理。

感受态细胞是指处于摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。

转导是指通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径将外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。

聚乙二醇（PFG）和多聚赖氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。

哺乳动物细胞能捕获粘性附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，并能将DNA转入细胞中，从而实现外源基因的导入。