临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
13!检验科PCR实验室标本采集、运送、接收、拒收及保存程序
标本采集、运送、接收、拒收及保存程序第一部分 HPV检测标本1 目的：保证HPV标本的质量。
2 范围：临床采集、运送、接收及实验操作人员。
3 内容：3.1 HPV标本采集标准操作流程3.1.1由经过宫颈脱落细胞标本采集专业培训的妇科医生用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈（取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）。
3.1.2将专用宫颈刷以适中力度接触于宫颈口，轻轻转动宫颈刷使其顺时针旋转3-5圈，并停留数秒钟。
3.1.3慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的专用标本管中，折断其刷柄，拧紧瓶盖。
3.2 HPV标本采集注意事项3.2.1月经期不可采集标本（减少给受检者的损伤）。
3.2.2月经正常妇女，在月经来潮后10～18天为最佳检查时间。
3.2.3不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本（可能会抑制PCR反应）。
3.2.4取标本前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物（可能会抑制PCR反应）。
3.2.5取标本前48小时最好不要行性生活（可能出现一过性假阳性）。
3.2.6样本采集后，注意避免交叉污染。
3.3 HPV标本运送的标准操作流程所有临床标本在采集后立即送至实验室放在2~8℃保存。
3.4 HPV标本接收的标准操作流程3.4.1 HPV标本由实验室标本室进行接收，查对是否贴有标签、标本是否有洒落、破损，查对标本、申请单信息、刷卡信息是否相符，有异常情况的标本，视为拒收标本，应填写《标本拒收登记表》并根据情况处理。
3.4.2标本室实验人员对接收的标本进行编号，（此编号为样本唯一编号），然后与PCR实验室人员进行交接并实行严格登记制度。
3.4.3 PCR实验室人员对已接收的标本按正常标本、血性标本、粘液标本进行分类登记。
3.4.4 由指定人员对接收的标本进行常规涂片用显微镜查看是否有上皮细胞，细胞数量在每视野≥3个为可进行HPV检测的标本。
3.4.5对于特殊的样本（包括危重病人或急出报告的标本等），实行“首接”负责制，及时处理，并进行登记。
PCR实验操作流程
1 PCR 实验操作流程（TB/LP/MPCP ）一、标本的核酸提取（痰标本）1、痰液液化：痰液加入四倍体积的4%NaOH ，摇匀静置30min ；（样本编号，离心管编号）2、将液化后的液体0.5ml 转至1.5ml 离心管中，再加入0.5ml 4%NaOH ，混匀静置10min 继续液化，13000rpm 离心5min ，去上清；3、加入1ml 生理盐水洗一次，振荡器震荡混匀，13000rpm 离心5min ，上清去除干净；4、沉淀直接加入100μl 核酸提取液（提取液使用之前混匀），混匀数秒，干热仪100℃加热10min ，然后13,000rpm 离心5min ，取上清4μl 作为PCR 反应模板。
二、试剂配制、加样三、PCR 扩增设置扩增循环参数设置：37℃×2min ，94℃×2min ，循环一次；93℃×15s ，60℃×60s ，循环40次，荧光检测在60℃×60s ，荧光通道FAM 和VIC 通道。
反应体系40μl 。
四、结果判断MPCP ：FAM 通道Ct ≤38，报告MP 为阳性；VIC 通道Ct ≤38， 报告CP 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，则判断为低于检测线，判为阴性LP ：FAM 通道Ct ≤38，报告LP 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，则判断为低于检测线，判为阴性TB ：FAM 通道Ct ≤38，报告TB 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，且扩增曲线呈典型的S 型，则判断为阳性；若非典型S 型曲线，则判断为低于检测线，判为阴性。
PCR实验室临床标本的采集、运送、接收程序
PCR实验室临床标本的采集、运送、接收程序1．目的：规范临床待检标本的正确采集、送检和处理。
2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。
3．负责人：操作人：4．程序：4．1 标本的采集4．1．1 标本由临床各科室接受过临床基因扩增检测有关标本采集、保存、运输知识培训的医护人员采集并送至实验室。
4．1．2标本采集要求a）血液标本：用2ml真空采集管或1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2小时内送达实验室（HCV采用EDTA 抗凝的血浆）。
离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml的离心管中，编号。
b）痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送检。
（对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl 水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。
）标本在室温下保存不能超过24小时。
c）生殖道拭子：尿道或阴道分泌物由医生用专用取样拭子（灭菌，一次性）采集样本，及时送检。
采集生殖道拭子标本，要求男性病人在采样前2小时内不能排尿，采样时，将棉拭子伸入男性尿道及女性宫颈口2～3cm，转动一周以获得上皮细胞。
d）尿液：由病人自留尿液于无菌封闭的杯中送检。
e）脑脊液和胸腹水：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。
注意：所有上述用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封。
4．2 标本的运送标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽可能快的送至检测实验室，如运送时间需2小时以上，必须用冰盒送至实验室。
标本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC）的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。
4．5 接收4．5．1严格对各类样本的查对和双签制度，对病房各样本及时进行验收，查对，不符合要求的样本一律退回，并有书面记录。
PCR实验室临床标本的保存程序
PCR实验室临床标本的保存程序
1. 目的：为保持标本的状态，防止因外界条件改变对标本产生影响，保证检验结果的准确性。
2．范围：PCR实验室接收的标本。
3．职责：工作人员负责标本的贮存，保证标本状态的稳定。
4．程序：
4.1 工作人员应认真核对所接收的标本，按检测项目将送检标本分类。
4.2 血清/血浆样品：将样品离心，吸出血清/血浆，作好标记，按编号排列，置-20℃贮存。
4.3 用于DNA检测的核酸样本如需要保存时应在10mmol/Ltris、1mmol/LEDTA缓冲液（pH7.5-8.0）中，放置在标本处理区冰箱中4℃保存。
用于RNA检测的核酸要本应在缓冲液中-80℃保存。
4.4 样品出现问题的处理：样品在保管期内，一旦出现变质丢失等问题，有关人员应如实向科主任或技术负责人报告，并通知送样科室。
必要时，重新送样品。
4.5 所有样品均留有备用样品，供复检时使用。
4.6 样品移交：当样品在室之间或者虽在同一室内但在不同组间移交时应有移交记录和签字。
4.7 安全处理：自生物体的任何样品都应认定具有传染性，应按《实验室生物污染物处理程序》由专人进行处理。
4.8 样品保留时间：样品应在报告发出后，至少保留一月。
由专人处理，并记录。
4.9 诚实性、保密性：科室有义务为委托方保密，保证检验公正性和保密性。
5 引用的记录本附表003 标本超低温保存及处置记
录表。
临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3讲述
标本采集
其他体液（TB/EBV-DNA等病原）
痰：深部痰液，不是唾液 胸腹水：无菌抽取，加抗凝剂 尿液：尿道口消毒，中段尿 鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNA
分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）
的整个提取操作过程中,都应戴一次性手套。 在RNA提取实验中，应勤换手套。
RNA提取的常用方法
表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。 胍盐提取结合氯仿-酚抽提法。 胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。
核酸提取的改良方法
旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法 玻璃粉吸附法 二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 微量全血核酸提取法 ：NaI 方法 其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自动核酸纯
去除或减轻抑制的一些方法
加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对Taq DNA聚合 酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通 常血液含量只能是0.2%。
BSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类 标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。
血红蛋白
1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+浓度无关。Tth聚合酶在 含4%（V/V）血液的PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链 DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V） 血液情况下，仍可扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现 从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。
单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法共66页
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
PCR实验室检验标本采集、接收及管理程序
1.目的对标本采集前患者的准备、标本采集、接收、保存进行规范，以控制各环节可能出现的误差，确保检验结果准确可靠。
2.范围核酸检测的所有标本。
3.职责由PCR实验室负责制定程序文件，由专业技术人员负责执行。
4.内容4.1标本采集4.1.1血液标本：4.1.1.1原始标本采集的标本类型是静脉血，根据不同检测项目选用不同类型的一次性真空采集管。
全血或血浆标本采用EDTA抗凝的紫色真空采血管，不可使用肝素或肝素盐抗凝，此类抗凝剂能强烈抑制Taq酶的活性。
血清标本采用不含抗凝剂的真空采血管。
4.1.1.2用于RNA检测的标本，应用核酸专用管或无RNase的采集管，应尽快送检，以立即分离血清为好，将血清转移至1.5ml无RNA酶的无菌离心管中，冷藏或冷冻保存，以避免RNA的降解。
标本若不能及时检测，应保存于-20℃，并避免标本的反复冻融。
4.1.2分泌物标本：4.1.2.1尿道：对男性患者，先用生理盐水清洗尿道口，将男用取材拭子插入尿道内2cm-4cm，旋转10-20秒再取出，以采集到粘膜上皮细胞。
对女性患者，可抵着耻骨联合轻轻按摩尿道后，用同男性相似的方法取材。
如有明显溃疡或疣状物，可取溃疡或挑破疣体取分泌物。
男性尿道样本采集前24小时内禁止尿道用药，2小时内不能小便。
4.1.2.2女性生殖道：取用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内约2-6cm，旋转10-20秒采集宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌专用管，密闭送检。
女性生殖道样本采集需选择在非月经期，采样前24小时内应禁止阴道冲洗、阴道用药。
4.1.2.3样本的处理：将取样后的拭子放入1.0ml的无菌生理盐水中漂洗片刻。
吸取液体转移至1.5ml 离心管中用于检测。
待测样本在2-8℃保存2周，-20℃保存不超过3个月，-70℃以下长期保存，应避免反复冻融。
4.1.3痰液标本的采集:4.1.3.1患者清晨清水漱口后，深咳出气管深处第一口痰于清洁干燥无菌带盖的容器内。
临床基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法
棉拭子
在使用PCR方法检测性病病原体时,临 床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。
如不立即用于核酸提取,则需保存于定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。
RNA提取所用器皿的处理
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基 本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA.
实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于 180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水 溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。
2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制 酶活性。
在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。
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标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处SP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 ,充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
痰
痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊