蛋白纯化中去除色素方法合集
蛋白质除杂的方法
蛋白质除杂的方法蛋白质是生物体内非常重要的分子之一，它在细胞结构和功能调控中起着关键作用。
然而，在研究和应用蛋白质时，常常需要将其与其他杂质分离，以提高纯度和准确性。
本文将介绍几种常用的蛋白质除杂方法。
一、盐析法盐析法是一种常用的蛋白质除杂方法，其基本原理是利用蛋白质与盐溶液中的离子相互作用，使蛋白质发生沉淀。
通常，可以通过逐渐增加盐溶液中的盐浓度，使蛋白质与盐发生离子相互作用而沉淀下来。
这种方法可以有效地除去一部分杂质，但对于某些蛋白质来说可能效果较差。
二、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种通过分子大小来分离蛋白质的方法。
在凝胶过滤柱中，较大分子的蛋白质会被滞留在凝胶中，而较小分子的杂质则可以通过凝胶被洗出。
这种方法可以根据蛋白质的分子大小选择不同孔径的凝胶过滤柱，从而实现对目标蛋白质的除杂。
三、离心法离心法是一种通过离心力将蛋白质与杂质分离的方法。
在高速离心的作用下，蛋白质和杂质会在离心管中分层，从而可以通过调整离心条件让蛋白质与杂质分离。
这种方法适用于蛋白质和杂质的密度差异较大的情况。
四、亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与特定配体之间的特异性相互作用来分离蛋白质的方法。
具体来说，可以将具有亲和性的配体固定在固相上，然后将蛋白质溶液加入，目标蛋白质会与配体发生特异性结合，从而被固定下来，其他杂质则可以被洗掉。
最后，可以通过改变条件或使用竞争性洗脱剂来解离蛋白质与配体的结合，使蛋白质从柱上洗脱出来。
蛋白质除杂是蛋白质研究中不可或缺的一步。
盐析法、凝胶过滤法、离心法和亲和层析法都是常用的蛋白质除杂方法，它们各自具有特定的原理和适用范围。
在实际应用中，根据需要选择合适的方法，可以有效地除去杂质，提高蛋白质的纯度和准确性。
树脂串联脱色脱蛋白
树脂串联脱色脱蛋白
树脂串联脱色脱蛋白是一种常用的分离纯化技术，主要用于去除溶液中的色素和蛋白质等杂质。
其原理是利用树脂的吸附作用和离子交换作用，将色素和蛋白质等杂质吸附在树脂上，然后通过清洗和洗脱步骤，将杂质从树脂上彻底去除，从而实现脱色脱蛋白的目的。
树脂串联脱色脱蛋白的具体步骤包括：
装柱：将适当大小的树脂装入柱中，确保柱子填充均匀，没有死角。
吸附：将待处理的溶液通过柱子，使色素和蛋白质等杂质吸附在树脂上。
清洗：用适当的清洗剂冲洗柱子，以去除未被吸附的杂质。
洗脱：用适当的洗脱剂将吸附在树脂上的杂质洗脱下来，收集洗脱液。
再生：用适当的再生剂对树脂进行再生，以便重复使用。
树脂串联脱色脱蛋白技术具有分离效果好、操作简便、成本低廉等优点，因此在生物制品、食品、制药等领域得到广泛应用。
细胞色素C的分离纯化
市售固体硫酸铵中一般残 留有硫酸，所以制备的饱和 硫酸铵溶液的pH常在4.5～ 5.5之间广使用之前应该用氢 氧化铵调节，使其pH为7。用 固体硫酸铵盐析时，蛋白质
应溶解于具有一定缓冲能力的溶液中，并 且在加入硫酸铵时应注意溶液pH的变化， 必要时加入氢氧化铵调节pH至7。在粗制 硫酸铵中还含有下些重金属离子，用量大 时易使蛋白质变性，在这种情况下可加入 一些EDTA等螯合剂以螯合这些金属离子。
同时与水分子形成水膜，这些因素保证 蛋白质形成溶于水的溶胶状态。当加入 少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性 基团，因而增大了蛋白质在水中的溶解 度，出现“盐溶”现象。一但当盐浓度 增加到一定浓度时，一方面大量的水同 盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水 维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水 胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加 入的盐离子中和了蛋白质分子表面的极 性
式中 V0——蛋白质溶液的原始体积； C2——所要达到的硫酸铵饱和度； C1——原来溶液的硫酸铵饱和度；
V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。
将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加 入到混合蛋自质溶液中，即可达到盐析 的目的。严格讲，混合两种不同溶液时， 混合后的总体积并不等于混合前两种溶 液体积之和，而上式中是按相等于计算 的，所以会产生误差。但实验证明所造 成的误差一般小于2%，故可忽略不计。
计算总含量（75g心肌）
分别取2号与3号管A的平均值和4号与5号管A的平均值， 并都减去1号空白管的A值，然后按以下公式计算。
标准管A520nm值：标准含量＝样品管A520nm值：χ
标准含量×样品A520nm值 χ=
标准A520nm值
总含量＝χ× 稀释倍数×总体积 理论上250mg/1kg猪心,实际提取200mg粗品/1kg 和150mg精品/1kg,但实验中大多数在7～10mg粗品 /75g猪心.
蛋白质分离和纯化的方法和技术
蛋白质分离和纯化的方法和技术蛋白质是生命体中极其重要的一种物质，它是细胞的基本组成单位，参与了多种生物学过程。
研究蛋白质在细胞中的功能与结构，需要对蛋白质进行高效、可靠的分离和纯化。
本文将介绍常用的蛋白质分离和纯化的方法和技术。
一、离子交换层析离子交换层析是分离蛋白质最常用、最成熟的方法之一。
其原理是利用蛋白质的电荷性质与离子交换树脂的对应性质，进行蛋白质的分离。
离子交换树脂可分为正离子交换树脂和负离子交换树脂两种类型。
正离子交换树脂的功能基团有负电荷，故可吸附具有正电荷的物质，例如氨基酸、多肽或蛋白质N端等；负离子交换树脂的功能基团有正电荷，故可吸附具有负电荷的物质，例如天冬氨酸、谷氨酸、磷酸基或蛋白质C端等。
根据目标蛋白质的电荷性质，选择合适的离子交换树脂进行分离。
离子交换层析速度较快，可分离多种电荷性质的蛋白质，但对样品的盐浓度要求较高，易受pH和盐浓度的影响，操作时需谨慎。
二、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是利用孔径大小对蛋白质进行分离的方法。
凝胶过滤层析常用的凝胶有玻璃纤维、纤维素等。
玻璃纤维凝胶一般有不同的颗粒大小，大的颗粒孔径大，小的颗粒孔径小。
蛋白质分子较小，可通过大孔径的颗粒进入凝胶孔隙，而较大的物质被挡在颗粒外部无法穿过凝胶。
因此，蛋白质经过凝胶时易出现分子量排阻效应，使得小分子在大分子之前流出，从而实现了蛋白质的分离。
凝胶过滤层析操作简单，无需特殊设备或条件，但分离程度相对较低，不适宜纯化目标蛋白质。
三、亲和层析亲和层析是利用蛋白质与亲和柱中特定配体发生特异性结合，从而对蛋白质进行分离的方法。
亲和层析适用于具有特定结构、功能或序列的蛋白质，例如抗体、标签化蛋白、细胞受体等。
常见的亲和柱配体有融合蛋白、金属离子、细胞色素C等。
蛋白质样品在亲和柱上进行结合，待不结合蛋白质被洗脱后对结合蛋白质进行洗脱。
亲和层析具有选择性强、纯化程度高等优点，但亲和柱的制备成本较高，操作上也需注意其特异性。
四种蛋白纯化方法
四种蛋白纯化方法1. 溶液沉淀法溶液沉淀法是一种常用的蛋白纯化方法，适用于从复杂的混合物中分离目标蛋白。
该方法基于蛋白质在不同条件下的溶解度差异，通过添加盐类或有机溶剂来诱导蛋白质的沉淀。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.溶解度测试：在不同条件下（如pH、温度、盐浓度等）测试目标蛋白质的溶解度，并确定最适合其沉淀的条件。
3.沉淀：根据前一步骤确定的最佳条件，向样品中添加盐类或有机溶剂，使目标蛋白质发生沉淀。
可以通过离心将沉淀物与上清液分离。
4.溶解：将沉淀物重新溶解在适当的缓冲液中，得到纯化后的目标蛋白。
优点：•简单易行，不需要复杂的设备和操作。
•适用于从复杂混合物中纯化目标蛋白。
缺点：•可能会导致非特异性沉淀，使得纯化后的蛋白含有杂质。
•沉淀方法对蛋白质的溶解度要求较高，不适用于所有蛋白。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于分子大小的蛋白纯化方法，适用于分离不同分子量范围的蛋白。
该方法利用孔径可调的凝胶柱或膜来分离目标蛋白和其他小分子。
步骤：1.样品制备：将待纯化的样品经过初步处理，如细胞破碎、组织切割等，得到含有目标蛋白的混合物。
2.凝胶柱选择：根据目标蛋白的分子量范围选择合适孔径的凝胶柱或膜。
3.样品加载：将样品加载到凝胶柱上，并使用缓冲液进行洗涤，以去除小分子。
4.蛋白洗脱：通过改变缓冲液的组成或pH值，使目标蛋白从凝胶柱上洗脱下来。
5.收集纯化蛋白：将洗脱得到的蛋白收集起来，即可得到纯化后的目标蛋白。
优点：•可以根据分子量范围选择合适的凝胶柱，实现高效分离。
•纯化后的蛋白质纯度较高。
缺点：•操作相对复杂，需要一定的专业知识和技术。
•只适用于分子量差异较大的目标蛋白。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子间特异性相互作用的蛋白纯化方法，适用于富含目标蛋白的混合物。
该方法利用目标蛋白与特定配体之间的亲和力进行分离和纯化。
sds电泳脱色技巧
sds电泳脱色技巧
SDS-PAGE电泳染色脱色时间较长，如果急于看结果，可以采用以下方法：
1. 将胶转移到适当大小的玻璃平皿中，倒入考马斯亮蓝染色液，液面能覆盖胶面即可，然后用另一平皿盖住表面，放入微波炉中加热，一见沸腾，立即停止，然后放在摇床上摇5分钟左右即可，这样的染色效果很好。
2. 脱色也可采取相同的方法，只不过把考马斯亮蓝染色液换成脱色液，脱色时可以多摇几分钟，多换几次脱色液，效果很好。
采用上述方法需要注意在微波炉中加热时间不可太长，一沸腾立即停止加热，否则容易将染色液渐出。
此外，还有其他一些技巧：
1. 可以在45℃左右的水浴中进行染色和脱色，时间会缩短。
2. 用乙醇和乙酸配脱色液，然后加热脱色，很快的，可加热到马上要沸腾为止。
3. 用蒸馏水洗胶，并放在微波炉里加热。
只是要掌握好时间，时间太长而蛋白的含量又比较低的话，容易脱过了。
4. 加入甲醇-乙酸脱色液后，将其直接放到微波炉里加热一分钟，然后放几张干净的tissue进去（把它叠成条状，沾在脱色皿边上就OK啦！不要和胶混在一起），能吸去很多染料，加快脱色。
以上方法仅供参考，可以根据实际情况选择合适的方法。
蛋白质纯化常用方法
蛋白质纯化常用方法蛋白质纯化是一种分离高纯度蛋白质的过程，可用于研究物种的功能和结构。
蛋白质纯化可以是一个繁琐的过程，通常需要多步骤的分离和纯化。
以下是一些常见的蛋白质纯化方法。
一、离心分离离心分离是根据蛋白质的分子量和密度差异来分离不同的成分。
高速离心法可分离细胞质组分、胞器、膜蛋白和核酸等。
低速离心法可从混合物中净化纤维蛋白、酶、酰化酶等。
二、盐析盐析是将溶液中的蛋白质与一定饱和度的盐混合后，通过离子间作用而使蛋白质发生沉淀的过程。
盐的浓度、pH值、离子类型和温度等因素会影响到沉淀的生成和纯度。
盐析也可以通过凝胶过滤或离子交换等方法来提高效果和纯度。
三、凝胶柱层析凝胶柱层析是一种将混合物缓慢地通过一个由多种凝胶材料组成的列的过程。
该列可根据蛋白质大小、电荷、亲疏水性等特性进行选择。
通过这种方法，可以净化蛋白质并快速消除杂质、缓解蛋白结构等。
四、亲和层析亲和层析是一种利用配体与蛋白质间的特定的结合进行选择性分离的技术。
配体通常被共价结合在凝胶上, 一些常见的配体包括金属离子、抗体和亲和素等。
通过这种方法，可以高效且选择性地纯化蛋白质，并减少染料、盐和杂质的存在。
五、电泳电泳是根据蛋白质的电荷大小将充电的蛋白质分离开的过程。
根据电泳类型不同，可以区分不同细胞蛋白、酶、抗体等。
蛋白质电泳在生物化学实验室中广泛应用，是一种可视化分离的传统方法。
六、共沉淀共沉淀是基于化合物的亲和性，在溶液中同时存在的两种蛋白质之间发生非共价结合的过程。
通过共沉淀获得的纯化蛋白质收率较高但一般会伴随着蛋白质活性的损失。
总之，纯化蛋白质的过程需要结合样品的特性和分离纯化方式的优点和局限性，选择合适的技术来获得高纯度和活性的蛋白质。
蛋白调用及染色脱色实验方案
蛋白调用及染色脱色实验方案
(1)考马斯亮蓝染色液 1000mL:
先称取考马斯亮蓝R250 10g于1000mL试剂瓶内，加入甲醇450mL 溶解，再加冰醋酸 100 mL和双蒸水450mL至大约1000mL。
室温可放置12个月以上。
染色液可倒入专用的回收试剂瓶，届时加入适量甲醇、考马斯亮蓝和大约10g/L的三氯乙酸后可重复使用。
(2)考马斯亮蓝脱色液10L:
千101洁净塑料桶内装入工业乙醇21，冰醋酸500ml，加入去离子水至10L，混匀，室温可放置12 个月以上。
(3)蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色。
凝胶的染色和脱色干合话体积的微波炉盒中讲行。
电泳后的凝胶加入染色液(以刚没过凝胶即可)。
干微波炉加热约40-70sec至染色液刚刚沸腾(注意塑料盒的盖子不要盖的太紧以防染色液爆洗出)，然后于脱色摇床上继续染色约10min即可。
染色液请倒入专用的回收容器内。
以自来水小心地淋洗凝胶冲去金热料，然后倒入活量的脱色湾，微波加执至刚沸腾后干热色摇床上探动公10 min，倒掉脱色液，此时凝胶的蛋白条带即可看清。
重复以上脱色步骤一次，即可看清电泳条带。
扫描凝胶蛋白条带需要完全脱掉背景颜色，这需要重新换上脱色液室温摇床脱色2h以上。
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多数色素中性条件下带负电荷，根据你色素的性质，可以采用合适的pH值，上阴离子柱，寻找一个合适条件，这个条件你的蛋白不挂，而色素可以挂住，缓冲液充分洗掉蛋白后高盐去除填料上的色素杂质。
可以试试。
另外，如果所含色素和蛋白分子量相差很大，可以采用透析的方法，找一个截留半径合适的袋子试试。
超滤也是个好办法，但色素如果分子量比较大的话，最好不要用millipore的那种超滤装置，我用30000截留半径的膜竟然能留下10000多的物质。
供参考！
不大同意作者的意见，其实色素挂柱后是非常难以洗下来的，用高盐洗不下，用NAOH后更是发生共价结合，绝对洗不下来，对柱子的损害是比较大的。
建议还是在上柱前处理，有时可以采用温和的萃取方法出色素，个人意见。
You can use reverse-phase HPLC to remove the pigments if your protein is not denature after it.
色素一般使用阳离子交换色谱和疏水色谱,不吸附色素,另外,如果你的蛋白分子量大的话,可以考虑使用超滤,色素都是一些分子量小的分子.
通过IEC、HIC等去除色素效果不理想，而且色素的存在会影响树脂的寿命，我建议采用超滤，效果相对较好。
色素应该用什么从阴离子柱上洗脱啊，我用了2M氯化钠，0.1M盐酸，1M氢氧化钠洗，但洗得不是很彻底，柱载量下降了
∙+1 积分
∙3楼
色素难去,你可以用少量的样品稀释上柱,看流穿的液体颜色有没有变化,如果没有,那恭喜你, 色素不挂,那不就可以了,如果挂住了,你洗脱你的蛋白看有没有色素混合,如果没有也可以, 挂在柱子上的色素再用酸碱洗以及乙醇等,都可以把大多色素洗下来.你可以加点活性炭试试.
色素的种类特别多，大分子的，小分子的，带正、负电荷等。
你现在肯定不知道你的溶液中
含有的色素的性质。
我的发酵液也是含有大量的色素但是我过阳离子柱的时候色素没有挂在柱子上全被冲下来
了。
如果你的色素比较浓且几乎成油状，你觉得过疏水柱如何？我的理解是：你的目的蛋白的分
子量一般不会和色素的分子量大小一样，故有可能能起到分离的效果。
不至于那么严重吧，我们这段时间的研究发现，色素和阴离子结合特别牢固，你可以按照正
常上样，上样后用梯度为10-20%的高盐溶液冲洗，蛋白质和阴离子结合不太牢固所以会被
洗脱下来，然后在用50-100%的高盐溶液冲洗，色素就会被洗脱下来；但要注意如果是用
预装柱的话，在样品上柱之前先要把样品用0.22um的滤膜过滤。
除色素的办法可以采用：硫酸铵沉淀、活性炭吸附（对蛋白也有一定的吸附）、离子交换或
疏水层析柱，具体哪个方法好，你可以尝试一下，我觉得离子交换或活性炭比较好。