基因重组蛋白纯化流程
基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。
二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。
上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。
✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。
✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组蛋白转染实验步骤
重组蛋白转染实验步骤
重组蛋白转染实验的步骤包括以下几个部分：
1.重组蛋白的表达和纯化：首先，通过基因工程技术将目的基因克
隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞中进行表达。
表达出的重组蛋白需要进行纯化，通常采用亲和层析、离子交换层析等方法进行分离纯化。
2.重组蛋白的转染：将纯化后的重组蛋白导入到细胞中，常用的转
染方法包括磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等。
转染时需要优化转染条件，如蛋白质浓度、转染时间、转染温度等，以提高转染效率和细胞存活率。
3.细胞培养和观察：将转染后的细胞放置在适当的培养条件下进行
培养，观察细胞的生长和形态变化。
可以通过荧光显微镜、免疫荧光等技术检测重组蛋白在细胞内的表达和定位。
4.数据分析：对实验数据进行统计分析，比较不同处理组之间的差
异，并评估重组蛋白对细胞生长、凋亡等生物学过程的影响。
需要注意的是，重组蛋白转染实验需要遵循相关的实验室安全规定，如穿戴防护服、手套等个人防护措施，以避免实验操作过程中可能产生的危险。
同时，实验前需要进行充分的文献调研和实验设计，确保实验的科学性和可行性。
重组蛋白 工艺流程
重组蛋白工艺流程
重组蛋白工艺流程：
目标基因的扩增。
首先，需要设计引物，这些引物应避开目标蛋白的跨膜区和二级结构，如选择N端或C端的序列。
这些引物的设计结合了目标蛋白的结构信息和基因信息，并通过第三方公司合成。
插入克隆载体。
利用PCR技术，根据目标蛋白的特异表达组织，使用设计的引物进行PCR扩增，然后进行酶切和连接，将目的片段与载体结合。
亚克隆到表达载体中。
将连接好的目的片段转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，并进行挑菌验证，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳来确认目的片段是否成功插入载体。
蛋白表达。
在特定的条件下，如诱导剂的存在，将重组载体转化到宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞或杆状病毒-昆虫细胞系统，进行蛋白的表达。
蛋白的鉴定和纯化。
通过SDS-PAGE和western blot或荧光等方法进行蛋白的鉴定，由于载体中通常包含标签（如His标签），可以使用特定的纯化方法，如镍柱纯化，来分离和纯化重组蛋白。
质量检测和保存。
纯化后的蛋白会进行冻干处理，并进行常规的蛋白质实验验证其分子量和纯度，纯度通常需要超过95%。
通过测试后，蛋白会被储存。
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
质的衍生物为载体，在某一 pH 条件下，这些 载体带有正电荷或负电荷，当待分离蛋白质分 子通过载体时，离子交换使蛋白质分子分离纯
机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小 易于控制，但应用范围窄
不能进行快速淋洗，且分离时间长，易造 成生物 分子的变性、失活
离子交换层析是发展最早的层析技术之一， 目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段
• 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊 杂质种类和最大允许量。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
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三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。 ②步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互适应，一般分离 原理相同的技术在工艺中不要重复使用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。 ③技术条件要温和，温度低，PH值适中，能保持目的产物的生物活性。 ④工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质盆。 ⑤周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率、质量会下降。 ⑥目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分离出来，达到较高 纯化倍数。 ⑦工艺和技术必须快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。 ⑧具有较高的安全性。在选择处理技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂 质，保证产品质量和作用安全以及生产过程的安全，药品生产必须保证安全、无菌、 病毒、热原。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，
常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵 等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、 溶解度大等优点，现在所指的盐析法实
该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、上述两种方法分离纯化蛋白质后，都要采
简答重组蛋白的生产流程
简答重组蛋白的生产流程
重组蛋白的生产流程是基因工程中一项令人振奋的技术，目前已被广泛用于药物发现，疾病诊断，抗体生产等领域。
重组蛋白的生产主要分为四个步骤：设计、合成、重组和表达。
第一步是设计。
在这一步，分子生物学家和药物研究员根据其工作的需求，设
计具有现代生物学方法，诸如结构预测、物种关系和其他遗传变体，生成重组蛋白的基因构建。
第二步是合成。
这步是用不同的生物材料来生产新的基因。
最常用的技术是多
聚体PCR，它使用法律的合成反应来从现有的原序列中切割出设计好的重组蛋白基因。
第三步是重组。
在这一步，研究员将合成好的基因携带载体质粒中，从而使它
在一个细胞里被插入。
第四步是表达。
得到重组的基因后，重组蛋白就被按预期的方式在体外表达了。
表达通常会涉及到控制基因及细胞环境条件，确保蛋白质表达质量优良，质量最终需要检测验证。
重组蛋白的生产流程就是上面所描述的。
每个步骤都需要精准的安排，特别是
设计和合成，它们的不断改进可以使重组蛋白的生产变得更加容易。
重组蛋白纯化概述
重组蛋白纯化概述蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分，尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中，上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离，充分利用上游对下游的影响，对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。
是否带有亲和标签，His标签，GST标签等，不同的亲和标签选择不同的纯化方案；可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低；是否对宿主细胞具有毒性，从而选择抗毒性的表达系统；怎样选择表达系统，是大肠杆菌表达系统，酵母表达系统还是CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统；蛋白的化学性质，是否容易被蛋白酶降解，是否会和一些金属离子，化学成分发生反应；蛋白的物理性质，是否对温度敏感等。
从蛋白基因的获取，蛋白基因的克隆，蛋白的表达，做好一个整体的规划，将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。
基因工程构建的纯化标记有很多，通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
GST融合载体，蛋白A融合载体，含组氨酸标记（Histidine-tagged）等，不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。
一．含组氨酸标记（Histidine-tagged）重组蛋白的纯化（一）选择亲和标签时需要考虑的因素亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。
（1）亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能，大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。
重组蛋白纯化SOP
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM （约为58μg/ml）。
取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，直至菌体溶液变清澈为止。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。
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01.11 周总结一、本周工作01．0520T—TB23 蛋白处理1、分析昨天20T—TB23 蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清；2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M 尿素溶解上清中目的蛋白较少，6M 、8M 溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M 尿素去杂蛋白，用6M 尿素洗目的蛋白；3、用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2mi n,12000rpm 离心15mi n,再重复一遍；4、用30ml 2M 尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl) 将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，进行电泳；20T—I 56II12 菌体回收1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min ；2、去上清用20ml裂解液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.0620T—TB23 蛋白回收：1.将跑20T—TB23 蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条宽1cm 左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS 缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白溶液，稀释12 倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD 值为0.165,260nmOD 值为0.098，C=(0.165*1.45—0.098*0.74) *12=2.0；20T—I 56II12 蛋白处理：1 用正常Buffer 将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer 溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液(含20mmol/L Tris--Hcl)将沉淀吹起，超声2min,12000rpm 离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24 倍测蛋白浓度，280nmOD 值为1.041,260nmOD 值为0.579，C=(1.041*1.45—0.579*0.74) *24=25.9；往上清中加2.6ml 的5*loadingbuffer, 取40 微升于1.5ml 离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3 微升样品，共加4 板，进行电泳01.07协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12 蛋白1准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上(不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好)；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条1cm左右的凝胶条放在5%Cucl2溶液中染色，染色过程中注意轻轻摇晃染色盒；4、染色后观察目的蛋白在凝胶上的位置、确定切胶的宽度；5、用手术刀将目的蛋白带切下，切胶过程中注意不要产生碎渣，并用纯净水将切下的凝胶条冲洗干净；6、将切下的凝胶条放在透析袋中，加适量缓冲液扎紧袋口，在电泳槽中电洗脱2h之后，反插导线洗脱5min ； 7、洗脱后回收透析袋中的蛋白溶液，稀释12倍后测蛋白溶度，放冰箱4° C保存。
01. 09破碎分析P4—HB85P25—6蛋白：1、测菌浓度，取4只比色皿往第一个比色皿中用800微升移液枪打入2.4ml纯净水作为对照管，其它几个比色皿中加入 1.6微升纯水后，再加入800微升的菌液混匀，注意每取一个细菌培养液时要更换一次移液枪头，将比色皿放在紫外分光光度计中在600nm波长条件下检测0D值为0.856 ；2、制作大表：取1.5ml菌液于离心管中一―►12000rpm离心2min >吸去上清______ 往离心管中加入40微升水，20微升3*loadingbufer，注意吹匀-沸水煮10min,12000rpm离心6min -------- 去上清液5微升跑小胶观察蛋白表达情况；3、破碎，将2瓶P4—HB85P25-6培养基平均装在3只大离心管中，7000rpm离心3min后倒掉上清，倒扣在纸巾上吸干水分---------------- ►用20ml的裂解液将沉淀吹起，超声4min*3,每次间隔3min, ;4、离心，静置30min后，12000rpm离心25min,将上清倒置另一离心管中；5、将上清液进行5%--50%SAS浓度梯度分析，发现所有上清都有沉淀，于是再增加2%、3%、7%、8%的SAS 浓度梯度进行分析；5、加不同浓度的SAS后静置30min,12000rpm离心6min,观察各SAS浓度下沉淀出现情况，发现2%SAS条件下就有沉淀出现；6、由于该蛋白对SAS很敏感，选择用SAS为2%、3%、5%的样做上清和沉淀样，用SAS为7%、8%、10%、15%、20%、25%的样做上清样，做样时先取相应数量的 1.5ml离心管，往管中加入10微升的3*loadingbuffer，并在管上标明样品名称，再加入20微升的相应样品并混匀；7、跑小胶，将预先制好的13%小胶夹到电泳槽上，按大表，总沉淀，总上清，2%、3%、5%沉淀样，2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%上清样的顺序上样，其中总沉淀上7.5微升，上清样按不同浓度对应的量上样，其它上5微升，注意每次上样时要将针清洗3遍；8、电泳，上样完毕后用导线盖将电泳槽连到电泳仪上，调节电压100V 左右，样跑平后调节电压200V,直到指示剂跑到板底，结束电泳，将小胶拆下染色分析。
01.10P4—HB85P25—6蛋白处理1、根据跑粗抗胶的情况确定蛋白的处理方式为5%SAS直沉；2、用移液枪测得粗抗体积为20.8ml,加入饱和SAS的体积为V= (20.8*5%) (1—5%) =1.09ml,在冰浴的条件下将SAS加入，注意加入时速度不能太快；3、4° C环境放置30min;4、12000rpm 离心25min,去上清；5、参照以前的实验记录，用8ml 20mM PB将沉淀吹起；6、配置600ml 20mMPB+200mMNacl平衡溶液(三个蛋白共用)；7、准备一个10ml 柱子，加3ml 介质，加介质后让保护介质的酒精滴下，用6ml 平衡液洗5 次，每次在柱子中静置2min ，注意每次洗柱子的过程中不要让介质太干，以刚刚好液体滴完为止;8、将吹起的蛋白溶液12000rpm 离心15min;9、离心完后将上清加到柱子上亲和吸附1h（4°C 条件下）,注意此时柱子要盖上盖子，以防污染；10.用平衡液做稀释液配置100ml 200mM 咪唑+20mMPB+200mMNacl 洗脱液，准确量取咪唑200*100*68.8/1000*1000=1.376g, 用200ml 平衡液溶解，再量取8ml 洗脱液，用平衡液定容到80ml 配成20mM 咪唑+20mMPB+200mMNacl 洗杂液；11.将亲和柱从冰箱中取出，在室温下静置5min 左右后，收集从柱子中流出的穿透液；12.往柱子中加入6ml 平衡液，静置2min, 放掉平衡液并收集1ml 左右液体做样，用同样方法平衡9 次收集第1 次，第5 次，第9 次的平衡液做样（注意每次加平衡液后需要轻轻搅动一下柱子，但不要太猛烈以防吸附的蛋白脱落）；13.洗杂：往柱子中每次加入6ml 的平衡液，洗杂5 次，每次停留2min, 用5ml 离心管收集洗杂液；14、洗脱：往柱子中加入2ml、2ml 、1.5ml 、1.5ml 、2ml 、2ml 的洗脱液，每次停留10min, 收集每次洗脱液；15、将粗抗、总上清、穿透液、加样后收集的平衡液、洗杂液、洗脱液做样跑13%的小胶分析蛋白分布情况；01.11LXLMA29蛋白破碎分析：1.将菌溶液稀释3倍，600nm测吸光度值，P4—SD--SH 7 0.553、32E—TO100.675 、LXLMA290.871 ；2、制作大表，取1ml菌溶液，12000rpm离心2min,吸去上清，将沉淀用40微升纯水吹起, 加入20 微升loadingbufer,煮10min,12000rpm 离心10min;3、将菌溶液平均装在大离心管中7000rpm离心3min,去上清，沉淀用10ml/p裂解液吹起；4、将沉淀进行超声裂解,进口超声仪用70%功率，2 瓶培养基超声4min*3, 中间停留2min;5.超声完后，将裂解液倒入离心管12000rpm ，离心25min;6.观察沉淀颜色，如为褐色可能是上清表达，将上清用另一只离心管收集，并做一个总上清样，沉淀用正常buffer 吹起，做一个总沉淀样；7•上清SAS梯度分析，做从10%---50%的硫胺梯度，取上清90、85、80、75、70、65、60、55、50 微升加入10、15、20、25、30、35、40、45、50 微升的饱和SAS静置30min , 12000rpm离心6min ；8•观察沉淀出现的情况，用25%作为中间梯度，SAS浓度小于25%的将上清吸掉，沉淀用20 微升纯水吹起加10 微升3*loadingbuffer 做样，大于25%的取20 微升上清做样，25%的即做沉淀又作上清样；9、按一定的顺序将样品上小胶电泳后，将小胶用考马斯亮蓝染色液染色，再微波加热脱色分析蛋白分布情况；本周学习情况:1. 学习了包涵体的尿素处理过程，以及包涵体性质包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。