(精品)直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原
吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析
DOI:10.16662/ki.1674-0742.2018.16.191吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析徐秋波,黄丽娟靖江市人民医院检验科,江苏靖江214500[摘要]目的分析对CCP抗体采用吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测的临床作用。
方法方便选择2017年1月—2018年1月来该院检验科进行CCP抗检测的272例患者,所有患者均采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测,对各组检测结果进行分析比较。
结果采用吖啶酯直接化学发光法的CCP抗体诊断中,特异性为96.69%,敏感性为69.49%,阳性预测值与阴性预测值为87.13%、91.91%。
采用ELISA定量检测法的CCP抗体诊断中,特异性为97.06%,敏感性为68.01%,阳性预测值与阴性预测值为92.28%、86.03%;在类风湿性关节炎患者中,活动期CCP抗体含量(141.11±93.96)IU/mL,非活动期CCP抗体含量(45.15±10.56)IU/mL,由此可见类风湿性关节炎活动期CCP抗体含量明显高于非活动期(t=8.369,P=0.000);采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA检测的CCP抗体,阴性符合率为100.00%,阳性符合率为94.44%,总符合率为98.53%。
结论针对CCP抗体,吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测具有良好的符合率,吖啶酯直接化学发光法适合在仪器自动化中应用,易标准化,操作简单,与临床要求相符合。
CCP抗体作为类风湿性关节炎诊断的一种新血清学标志物,对类风湿性关节炎病情监测有利。
[关键词]吖啶酯直接化学发光法;ELISA定量检测;CCP抗体[中图分类号]R446[文献标识码]A[文章编号]1674-0742(2018)06(a)-0191-03 Quantitative Detection of CCP Antibody by Acridine Ester Direct Chemilu⁃minescence and ELISAXU Qiu-bo,HUANG Li-juanDepartment of Laboratory,Jingjiang People's Hospital,Jingjiang,Jiangsu Province,214500China[Abstract]Objective This paper tries to analyze the clinical effect of anti-CCP using acridinium ester direct chemilumi⁃nescence and ELISA.Methods272cases of CCP anti-detection were selected conveniently from January2017to January 2018in the laboratory.All patients were tested with acridinium ester direct chemiluminescence and ELISA.The results of each group were analyzed and compared.Results In the diagnosis of CCP antibodies using acridinium ester direct chemilu⁃minescence method,the specificity was96.69%,the sensitivity was69.49%,and the positive predictive value and negative predictive value were87.13%and91.91%.In the diagnosis of CCP antibodies using ELISA quantitative assay,the speci⁃ficity was97.06%,the sensitivity was68.01%,and the positive predictive value and negative predictive value were92.28% and86.03%;in patients with rheumatoid arthritis,active CCP antibodies content(141.11±93.96)IU/mL,inactive CCP anti⁃body content(45.15±10.56)IU/mL,it can be seen that the CCP antibody content of active rheumatoid arthritis was signifi⁃cantly higher than inactive period(t=8.369,P=0.000);CCP antibodies detected by acridinium ester direct chemiluminescence method and ELISA,the negative coincidence rate was100.00%,the positive coincidence rate was94.44%,and the overall coincidence rate was98.53%.Conclusion For CCP antibodies,acridinium ester direct chemiluminescence method and ELISA quantitative detection have a good coincidence rate,acridinium ester direct chemiluminescence method is suitable for application in instrument automation,easy standardization,simple operation,and in line with clinical requirements.As a new serological marker for the diagnosis of rheumatoid arthritis,CCP antibody is beneficial to the monitoring of rheumatoid arthritis.[Key words]Acridine ester direct chemiluminescence;ELISA quantitative detection;CCP antibodyantibody antibody[作者简介]徐秋波(1980-),女,江苏靖江人,本科,主管技师,主要从事检验科免疫检测工作。
化学发光试剂吖啶酯
化学发光试剂吖啶酯概述：吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，在碱性H2O2溶液中，吖啶酯的分子受到过氧化氢离子进攻时，吖啶环上的取代基能与吖啶环上的C-9和H2O2(过氧化氢)形成不稳定的二氧乙烷(此二氧乙烷可迅速分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当回到基态时发出光子)，则这类取代吖啶化合物可做为化学发光标记物。
一、发光机理：根据取代基的不同，常用作化学发光标记物的吖啶取代物分为两类:吖啶酯和吖啶磺酰胺。
它们的结构中都有共同的吖啶环。
它们的发光机理相同:在碱性H2O2溶液中，分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出最大发射波长为430nm的光子。
二、用途:化学发光试剂，吖啶酯类、1，2-二氧杂环丁烷类及过氧草酸酯类等化学发光体系，化学发光法与高效液相色谱、传感器技术以及流动注射技术等其他技术的联用，因具有分析速度快、设备简单、灵敏度高及线性范围宽等优点，已经广泛应用于化学食品安全、生物医学、环境检测等领域。
三、特点:1、发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。
2、吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光。
因此应用于化学发光检测具有许多优越性。
四、优点:1、背景发光低，信噪比高;2、发光反应干扰因素少;3、光释放快速集中、发光效率高、发光强度大;4、易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少;5、标记物稳定(在2-8℃下可保存数月之久)。
6、这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0.4s左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。
因此吖啶酯或吖啶磺酰胺是一类非常有效、非常好的化学发光标记物。
五、应用吖啶类化学发光体系因无需催化剂、反应条件温和、重现性好等优点，被广泛应用于无机有机化合物、生物及药物分析等领域。
乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立
ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０１９．０６．０３７ 收稿日期：２０１８０８３０；修回日期：２０１８１２１０ 通讯作者：颜光涛，研究员。研究方向：标记免疫分析技术。Ｅｍａｉｌ：ｙｇｔ３０１＠１６３．ｃｏｍ
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ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｊｕｎ．２０１９，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６
乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫 分析方法的建立
欧赛英１，潘杨滨１，陈秀发１，沙利烽１，梁 辰２，冯 杰２，薛 辉２，颜光涛２
（１．苏州长光华医生物试剂有限公司，江苏 苏州 ２１５１６３；２．中国人民解放军总医院医学检验中与临床 ２０１９年 ６月第 ２６卷第 ６期
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慢 性 乙 型 肝 炎 （乙 肝）病 毒 （ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ ｖｉｒｕｓ ＨＢＶ）感染可导致肝硬化和肝细胞癌等严重后果，从 而带来巨大 的 社 会 经 济 负 担，已 成 为 全 球 公 共 卫 生 问题。根据 ＷＨＯ公布数据，目前，全球 ６０亿人口中 约有 ２０亿感染过 ＨＢＶ，其中 ３．５亿为慢性感染者， 每年 约 有 ７８万 人 死 于 ＨＢＶ 相 关 性 肝 硬 化 和 肝 癌［１］。根据 ＨＢＶ基因组差异性大于 ８％，ＨＢＶ被分 成 １０种基因型（Ａ～Ｊ）及 ４０种不同的亚基因型，不 同基因 型 ＨＢＶ 流 行 病 学 特 征 不 同［２］。 ＨＢｓＡｇ是 ＨＢＶ感染后首先出现的血清标志物，预示价值高，是 目前临床上应用最多的血清标志物，也是 ＷＨＯ公认 的判断 ＨＢＶ感染的关键指标。随着检测技术的不 断发展，临床 检 测 和 血 筛 市 场 对 灵 敏 度 的 要 求 也 越 来越高，目前全球有多达上百个相关检测产品，包括 酶联免疫法、胶 体 金 标 记 法、化 学 发 光 等 分 析 方 法， 以化学发 光 法 的 灵 敏 度 为 最 佳［３］。 高 灵 敏 度、高 特 异性、以及定量检测是 ＨＢｓＡｇ检测的三大趋势。本 文根据化学 发 光 免 疫 定 量 分 析 的 原 理，采 用 吖 碇 酯 标记分析技术，用双抗体夹心法建立检测人血清 ／血 浆中 ＨＢｓＡｇ含量的方法，现将试验结果报道如下。
化学发光免疫技术及其在临床检验中应用论文
化学发光免疫分析技术及其在临床检验中的应用【摘要】化学发光免疫分析是基于放射免疫分析的基本原理，然后将高灵敏的化学发光分析与高特异性的免疫反应结合而建立的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。
这种技术操作方便，检测灵敏度高，且不会造成污染，是当前免疫分析中最完善的分析方法，也是免疫分析重要的发展方向，本文笔者就对这一技术及其在临床检验中的应用做一介绍。
【关键词】学发光免疫分析技术；基本原理；分类；应用文章编号：1004-7484（2013）-01-0463-01化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immuno-assay，clia），是在二十世纪八十年代发展起来的，它是比荧光免疫测定、酶免疫、发射免疫更先进的一种最新的免疫测定技术。
这种技术主要用于对各种抗体、抗原、半抗原、脂肪酸、激素和药物的检测分析，下面就介绍一下这种技术的基本原理和分类。
1化学发光免疫分析技术的基本原理化学发光免疫分析技术是由免疫分析和化学发光分析两个系统构成的。
其中免疫分析是用标记物直接标记在抗原或抗体之上的，然后再经过抗原与抗体反应生成抗体免疫复合物，其中标记物可以是化学发光物质，也可以是某种酶。
化学发光免疫分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，待发光物质氧化后就会形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测，其中被测物的含量就是根据化学发光标记物与发光强度的关系利用标准曲线计算出来的。
化学发光的原理是指分子或原子中的电子吸收能量后，发生能级跃迁而释放光子的过程，能级跃迁过程是电子从基态到激发态的过程，实现了从较低能级向较高能级的跃迁。
其中可以根据形成激发态分子的能量来源不同将发光过程分为化学发光（chemiluminescence）、光照发光（photoluminescence）和生物发光（bioluminescence）。
化学发光免疫分析技术
• 化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清内待测物质从而 对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清 和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不 透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结 合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的 游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液 ，利用化 学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能 量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通 过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔 的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学 模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊 断。
血清FT3和FT4降低： ⑴甲减病人两者皆下降，但轻型甲减、甲减初期多 以FT4下降为主；⑵低T3综合征仅有FT3下降； ⑶某些药物，如苯妥英 钠、多巴胺、糖皮质激素也可使FT3和FT4降低。
• T3、T4均升高：高TBG血症、甲亢、甲状腺激素不敏感综合征。
化学发光免疫分析
一、化学发光免疫技术的概念 二、化学发光免疫分析基本原理 三、化学发光免疫分析的类型 四、临床应用 五、发展与展望
一、化学发光免疫技术的概念
化学发光免疫技术：化学发光分析是根据化学反应统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与 待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入 化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或 定性检测。
磁微粒模式图
特点 – 抗原和抗体结合与未结合 部分的易分离
Y
3.2、化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗 体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固 相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物 (发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光 电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至 计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析
吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析作者：徐秋波黄丽娟来源：《中外医疗》2018年第16期[摘要] 目的分析對CCP抗体采用吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测的临床作用。
方法方便选择2017年1月—2018年1月来该院检验科进行CCP抗检测的272例患者，所有患者均采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测，对各组检测结果进行分析比较。
结果采用吖啶酯直接化学发光法的CCP抗体诊断中，特异性为96.69%，敏感性为69.49%，阳性预测值与阴性预测值为87.13%、91.91%。
采用ELISA定量检测法的CCP抗体诊断中，特异性为97.06%，敏感性为68.01%，阳性预测值与阴性预测值为92.28%、86.03%；在类风湿性关节炎患者中，活动期CCP抗体含量（141.11±93.96）IU/mL，非活动期CCP抗体含量（45.15±10.56）IU/mL，由此可见类风湿性关节炎活动期CCP抗体含量明显高于非活动期（t=8.369，P=0.000）；采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA检测的CCP抗体，阴性符合率为100.00%，阳性符合率为94.44%，总符合率为98.53%。
结论针对CCP抗体，吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测具有良好的符合率，吖啶酯直接化学发光法适合在仪器自动化中应用，易标准化，操作简单，与临床要求相符合。
CCP抗体作为类风湿性关节炎诊断的一种新血清学标志物，对类风湿性关节炎病情监测有利。
[关键词] 吖啶酯直接化学发光法；ELISA定量检测；CCP抗体[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）06（a）-0191-03[Abstract] Objective This paper tries to analyze the clinical effect of anti-CCP using acridinium ester direct chemiluminescence and ELISA. Methods 272 cases of CCP anti-detection were selected conveniently from January 2017 to January 2018 in the laboratory. All patients were tested with acridinium ester direct chemiluminescence and ELISA. The results of each group were analyzed and compared. Results In the diagnosis of CCP antibodies using acridinium ester direct chemiluminescence method， the specificity was 96.69%， the sensitivity was 69.49%， and the positive predictive value and negative predictive value were 87.13% and 91.91%. In the diagnosis of CCP antibodies using ELISA quantitative assay， the specificity was 97.06%， the sensitivity was 68.01%， and the positive predictive value and negative predictive value were 92.28% and 86.03%；in patients with rheumatoid arthritis， active CCP antibodies content （141.11±93.96）IU/mL，inactive CCP antibody content （45.15±10.56） IU/mL， it can be seen that the CCP antibody content of active rheumatoid arthritis was significantly higher than inactive period （t=8.369，P=0.000）； CCP antibodies detected by acridinium ester direct chemiluminescence method and ELISA， the negative coincidence rate was 100.00%， the positive coincidence rate was 94.44%，and the overall coincidence rate was 98.53%. Conclusion For CCP antibodies， acridinium esterdirect chemiluminescence method and ELISA quantitative detection have a good coincidence rate，acridinium ester direct chemiluminescence method is suitable for application in instrument automation， easy standardization， simple operation， and in line with clinical requirements. As a new serological marker for the diagnosis of rheumatoid arthritis， CCP antibody is beneficial to the monitoring of rheumatoid arthritis.[Key words] Acridine ester direct chemiluminescence； ELISA quantitative detection； CCP antibodyantibody antibody類风湿性关节炎属于系统性自身免疫性疾病之一，发病概率为0.5%～1.0%。
(精品)直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原
(精品)直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原直接化学发光免疫分析是一种广泛应用于生物医学研究和临床医学诊断的技术手段。
该技术以高灵敏度和高特异性为特点，能够快速准确地检测分子水平的生物标志物。
而吖啶酯作为直接标记抗体抗原的一种可行选择，具有独特的优势和应用潜力。
吖啶酯是一类荧光染料，具有发光能力，可以作为荧光标记物直接连接在抗体抗原上。
与传统的标记方法相比，吖啶酯直接标记具有操作简单、效率高等特点。
其原理是在免疫反应中，抗体与抗原结合形成复合物，吖啶酯标记物的发光信号则与目标分子的含量成正比，进而用于定量检测。
这种标记方式不仅可以用于体外实验室研究，还能够应用于临床检测中，如药物代谢动力学、肿瘤标志物的检测和传染性疾病的早期诊断等。
吖啶酯直接标记的优势主要有以下几个方面：首先，吖啶酯标记物具有较高的荧光强度和稳定性，使得检测结果更加准确和可靠。
吖啶酯荧光染料不仅在可见光区域有较高的发光强度，而且其激发和发射波长都与常用的荧光检测仪器相匹配，使得检测操作更加便捷和灵敏。
其次，吖啶酯直接标记的方法相对传统的标记方法更加简单快捷。
在传统的标记方法中，通常需要先标记抗体或抗原，再与荧光染料进行偶联，这个过程需要耗费较长的时间和精力。
而吖啶酯直接标记方法不需要额外的偶联试剂，只需将吖啶酯染料直接与抗体抗原接触，即可完成标记。
此外，吖啶酯直接标记方法在多种生物学实验中都能够获得良好的应用效果。
不同于一些其他的标记方法，吖啶酯直接标记不会影响抗体和抗原的结构和功能，确保了实验结果的可靠性和可重复性。
对于直接化学发光免疫分析技术的进一步发展，吖啶酯直接标记方法也值得进一步探索和研究。
虽然目前吖啶酯标记已经在一些实验和临床应用中得到了广泛应用，但是仍有一些问题亟待解决。
例如，吖啶酯标记物的发光强度和持久性有待进一步提高，以满足更高灵敏度和更长时间跟踪的需求。
此外，吖啶酯标记方法的选择性和特异性也需要进一步加强，以确保在复杂样本中的准确性和稳定性。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质（免疫反应性）。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
化学发光免疫分析方法的种类
【化学发光免疫分析种类】
1.直接化学发光
A 吖啶酯发光
原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。
代表仪器：拜耳公司的ACS180。
【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光
原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。
代表仪器：德国Byk–Sangtec公司的LIAISON
C 电化学发光
原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。
代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。
【化学发光免疫分析种类】
•2、酶促化学发光或持久发光
•原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上，纳米磁珠分离后的碱酶标
记的抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。
•特点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不如直接化学发光好。
•代表仪器：美国贝克曼公司的ACCESS，雅培公司的AXSYM。
吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析
吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析徐秋波;黄丽娟【摘要】目的分析对CCP抗体采用吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测的临床作用.方法方便选择2017年1月-2018年1月来该院检验科进行CCP抗检测的272例患者,所有患者均采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测,对各组检测结果进行分析比较.结果采用吖啶酯直接化学发光法的CCP抗体诊断中,特异性为96.69％,敏感性为69.49％,阳性预测值与阴性预测值为87.13％、91.91％.采用ELISA定量检测法的CCP抗体诊断中,特异性为97.06％,敏感性为68.01％,阳性预测值与阴性预测值为92.28％、86.03％;在类风湿性关节炎患者中,活动期CCP 抗体含量(141.11±93.96)IU/mL,非活动期CCP抗体含量(45.15±10.56)IU/mL,由此可见类风湿性关节炎活动期CCP抗体含量明显高于非活动期(t=8.369,P=0.000);采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA检测的CCP抗体,阴性符合率为100.00％,阳性符合率为94.44％,总符合率为98.53％.结论针对CCP抗体,吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测具有良好的符合率,吖啶酯直接化学发光法适合在仪器自动化中应用,易标准化,操作简单,与临床要求相符合.CCP抗体作为类风湿性关节炎诊断的一种新血清学标志物,对类风湿性关节炎病情监测有利.【期刊名称】《中外医疗》【年(卷),期】2018(037)016【总页数】3页(P191-193)【关键词】吖啶酯直接化学发光法;ELISA定量检测;CCP抗体【作者】徐秋波;黄丽娟【作者单位】靖江市人民医院检验科,江苏靖江 214500;靖江市人民医院检验科,江苏靖江 214500【正文语种】中文【中图分类】R446类风湿性关节炎属于系统性自身免疫性疾病之一，发病概率为0.5%~1.0%。
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化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以 发射光子的形式释放能量的化合物，称为化 学发光剂或发光底物。
㈠直接化学发光剂
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需 酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化 学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记 抗原或抗体。
1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化 时,发出波长为470nm的光，具有很高的 发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶 酮是该发光反应体系的发光体。
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
定时散射比浊法测定原理示意图
(二)速率散射比浊法（rate nephelometry）
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定 法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散 射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法， 每项检测仅1～2min即可完成。
三、免疫散射比浊法
原理
粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光 线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散 射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒 的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等 因素密切相关，其公式如下：
Iθ＝ I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)］ Nγ2λ4
免疫自动化仪器分析技术
第一节 免疫浊度测定的自动化分析 第二节 发光免疫测定的自动化分析 第三节 荧光免疫测定的自动化分析 第四节 酶联免疫测定的自动化分析
第一节免疫浊度测定的自动化分析
免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液 中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、 NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反 应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫 复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大， 即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
式I θ中为与入射光成θ角处散射光强度；λ和I0为入 射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折 射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度； N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器的距离；θ为散 射光与入射光的夹角（散射夹角）。
散射颗粒与散射光
• 两种散射：Rayleigh-散射（颗粒直径<<入射光波长: 均匀散射）、Mile-散射（颗粒直径≈或>入射光波长: 不均匀散射）
1．鲁米诺及其衍生物 2．金刚烷衍生物（AMPPD）
1．鲁米诺 鲁米诺发光原理
2．AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
发光剂的标记技术
• 分类： - 直接偶联：通过偶联反应使标志物分子中反应基团直
接连接到被标志物分子的反应基团上。
化学发光免疫分析的类型：
一：直接化学发光免疫分析 二：化学发光酶免疫分析 1.辣根过氧化物酶标记的化学发光 2.碱性磷酸酶标记的化学发光 三、电化学发光免疫分析
一、直接化学发光免疫分析
用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶 酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和 NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分 解、发光 。
• 速率-----指抗原抗体结合反应过程中，每一单位 时间内两者结合的速度。
抗原抗体复合物形成表
累积时间（秒）
复合物形成的量
形成速率值
5
8
-
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90
30
230
80
35
300
70
40
360
60
45
415
55
50
450
45
55
480
30
60
500
20
• 基本原理：抗原与相应抗体以一定比例混合后， 随着反应时间的延长，免疫复合物的总量逐渐增 加，而速率的变化由慢－快－慢，反应时间最快 的某一时刻称为速率峰。当反应液中的抗体量保 持过剩时，速率峰的高低与抗原含量成正比，仪 器自动通过标准曲线将速率峰值转化为所测抗原 的终浓度。
1. 仪器测定技术要点
• 检测分两时间进行： – ①预反应阶段----加少量样本与抗体反应，测定第 一次散射光信号（7.5-120s）； – ②反应阶段----加入全量待测样本，4分钟内测定 第二次散射光信号。
• 第二次散射光信号作为待测抗原与抗体形成复合物 颗粒产生的信号峰值，经计算机软件处理转换为待 测抗原浓度。
（三）方法评价
优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确
不足: ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大 ③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。
二、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 μm），在 遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒 凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单个胶乳 颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透 射光减弱或散射光增强。
N-甲基吖啶酮
2．三联吡啶钌 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是 电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA） 在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化 反应。
三联吡啶钌
电化学发光剂反应原理
㈡ 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。
（二）仪器工作过程
1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。
2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品） 与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体 反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。
3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线 拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算 出抗原浓度。
• 大多数蛋白质分子直径比光波长小很多，因而只产 生Rayleigh-散射
• Rayleigh散射：散射光的强度与复合物的量呈正比、 与入射光波长成反比。
• 散射免疫比浊分析时一定要保持抗体过量，以维持 抗原抗体复合物的相对不溶解性；
• 测定的散射信号值应在曲线的上升臂部位，浊度信 号与待测抗原量呈正比。
- 间接偶联：用功能交联剂在标志物分子和被标志物之
间插入一条链或一个基团，使两种物质通过“桥”连接成
结合物。优点：增加反应活性，减弱空间位阻效应。
被标志物保持自身的特性（抗体特性），又具有标志物特性（发光/催化发光）
1. 碳二亚胺（EDC）缩合法
2. 过碘酸钠氧化法
3．重氮盐偶联法
4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法
免疫比浊分析的影响因素和临床应用
（一）免疫比浊分析的影响因素
1.抗原抗体比例 2.抗体的质量 3.增浊剂的使用
4.伪浊度 5.入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位
7.标准曲线制备与质量控制
（二）临床应用
免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、 IgM、κ链、λ链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血 浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白 酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、转铁蛋白(TRF)、 铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白 (CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿 因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。
记技术以及计算机技术的出现，自动化免疫分析 技术引入临床
- 提高检测灵敏度，增加检测项目 - 缩短检测时间 - 提高实验结果的精确度和准确度
自动化免疫分析仪的共同特点
主机系统
样本处理 系统
试剂 系统
温育反应 系统
信号检测 系统
计算机系统
自动稀释 自动进样 自动清洗
信号处理及 数字转换
信号储存 分析报告
第二节发光免疫测定的自动化分析
三大经典标记技术
术放
酶
发
射
免
光
免
疫
免
疫
技
疫
技
术
技
术
自动化发光免疫分析系统的组成
1.样本盘 2.试剂盘 3.温育反应系统 4.固相载体清洗和分离系统 5.信号产生和检测系统 6.计算机数据处理和控制系统
基本概念
发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基 态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后 再返回到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。
速率散射比浊原理图
仪器测定技术要点
• 开启机器，进行定标 • 反应阶段 • 抗原过量检测
图20-6 抗原抗体反应散射光峰值的动态变化
抗原过量检测
(三)散射比浊方法评价
散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本 法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密 等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的 准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质量 要求很高。
免疫散射比浊法
• 定时散射比浊法 • 速率散射比浊法
(一)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入 待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段， 溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号 计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法 是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号 在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗 原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到 最低。