常见分子生物学实验
分子生物学研究中常见的实验技术概述
分子生物学研究中常见的实验技术概述分子生物学是现代生物学研究的一个重要领域，它对生物的分子结构、功能和遗传表达等方面进行了深入的探究。
分子生物学的研究实验技术十分复杂和繁琐，但也是该领域成功进行研究和取得重大成果的必要手段。
本文将从PCR、基因克隆、蛋白质表达等多个方面，为读者概述分子生物学研究中常见的实验技术。
一、PCR技术PCR技术是分子生物学研究中最为重要的实验技术之一，其全称是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）。
PCR可以扩增DNA片段，从而使其更容易进行分析，是现代生物学和医学研究的重要基础。
PCR背后的主要技术是DNA复制，尤其是DNA双链的分离和单链的合成。
PCR技术发明后不久，在医学诊断、犯罪学鉴定、基因克隆和进化生物学等领域中就具备了重要的应用。
二、基因克隆基因克隆是分子生物学研究中另一个十分重要的实验技术。
基因克隆指的是将遗传物质的特定区域复制到载体DNA或病毒DNA中，然后再将其插入到宿主细胞中重新组装的过程。
基因克隆最常用的载体是质粒pBR322，其能合成产生抗生素解毒酶，这种抗生素成为已知的大部分细菌所不能耐受的抗生素，这就使得具有质粒pBR322的细胞成为极为重要的参照物。
基因克隆技术是生物工程、生物医学和农业等领域中的一项重要技术，其潜力在许多应用领域中是不可替代的。
三、基因测序基因测序是分子生物学领域中使用广泛的技术之一，其主要功能是破译DNA的序列。
基因测序技术包括许多不同的步骤，从DNA提取和分离，到测序反应的设计和执行。
其中，DNA测序主要采用Sanger法、454 Pyrosequencing法、Illumina平台等多种技术，它们分别以不同的优势和的限制来优化测序结果和运行成本。
基因测序技术在医学、生物学、遗传学和医药研究等领域中都具有广泛应用。
四、限制性酶切限制性酶切是分子生物学研究中常见的一项实验技术，它是通过专一性的内切酶来切割双链DNA，形成特定的切点和切端。
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法1.DNA提取与纯化DNA提取是分子生物学实验中最常用的技术之一，用于从不同种类样本中提取纯化DNA。
常见的提取样本包括细菌、动植物组织以及人体样本。
提取过程通常包括细胞破碎、蛋白质除去、DNA溶解和纯化等步骤。
常用的提取方法包括酚/氯仿提取法、CTAB提取法和商业化提取试剂盒。
2.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种高效扩增DNA的技术，可将一小段目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
PCR反应通常包括DNA模板、两个引物、dNTPs（四种核苷酸单元）和DNA聚合酶等成分。
反应的核心步骤是多个高温循环，包括变性（解开DNA的双链）、退火（引物结合到目标序列）和延伸（DNA聚合酶合成新链）等步骤。
PCR广泛应用于分子克隆、基因表达研究、疾病诊断等领域。
3.转染和转化转染和转化是将外源DNA导入宿主细胞中的技术。
转染是指将DNA导入非真核细胞（如细菌）或真核无性细胞中，常用的方法包括电穿孔法、化学法和病毒载体介导等。
转化是指将外源DNA导入真核多细胞直至整个个体范围内，常见的方法包括冷冻转化、冲击转化和基因枪法等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
常见的表达系统包括细菌系统（如大肠杆菌）、酵母系统（如酵母菌）和哺乳动物细胞系统（如CHO细胞）。
表达后，蛋白质需要经过多个步骤进行富集和纯化，如离心、柱层析和亲和层析等。
以上仅是分子生物学实验方法中的一部分，随着技术的发展，分子生物学实验方法也在不断更新和扩展。
这些实验方法在疾病诊断、基因工程、生物学研究等领域发挥了重要作用。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学实验3篇
分子生物学实验第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的技术，被用于DNA的扩增和检测。
PCR技术已经成为了分子生物学和生物医学研究的基础技术之一。
PCR技术被广泛的应用于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。
PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA片段。
通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。
PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样本量小。
PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域的应用不断扩展和深化。
随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。
第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。
RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。
RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。
RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。
RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。
在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学常用实验技术
一CTAB 法微量提取植物总DNA1. CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的作用：CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB 与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。
2. β-巯基乙醇的作用：巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚轻易去除基因组DNA。
巯基乙醇有消泡的作用。
3. EDAT（乙二胺四乙酸）的作用：是一种重要的络合剂，抑制某些金属蛋白酶的活性，防止DNA被DNase 酶解。
4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。
因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。
但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。
折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。
也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
一般在室温下放置15－30分钟即可。
2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc 或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验1.基因克隆实验：基因克隆实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的DNA序列克隆到重组DNA分子中。
这个实验通常包括DNA的摘取、PCR扩增、限制性内切酶的消化、连接载体、转化大肠杆菌等步骤。
2. 蛋白质表达实验：蛋白质表达实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质表达到大肠杆菌等宿主细胞中。
这个实验通常包括将感兴趣的基因克隆到表达载体中，表达载体转化至宿主细胞，利用诱导剂等物质诱导表达蛋白质等步骤。
3. PCR实验：PCR实验是一种基于酶催化反应的分子生物学实验。
该实验通过模板DNA、引物、酶及核苷酸等原料，经一系列温度变化，扩增目标DNA片段。
该实验通常用于基因克隆、DNA测序、点突变检测等领域。
4. DNA测序实验：DNA测序实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是确定DNA序列。
这个实验通常包括PCR扩增、DNA纯化、测序反应、数据分析等步骤。
5. RNA干扰实验：RNA干扰实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
这个实验通常包括制备siRNA、合成siRNA、转染细胞等步骤。
6. 蛋白质纯化实验：蛋白质纯化实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质从混合物中提纯出来。
这个实验通常包括细胞裂解、纯化、检测等步骤。
7. 荧光检测实验：荧光检测实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用荧光分子标记分子或细胞等，观察其分布、表达及功能等。
这个实验通常包括荧光染色、荧光显微镜观察等步骤。
8. 基因编辑实验：基因编辑实验是一种新兴的分子生物学实验，其目的是通过基因编辑技术，直接改变DNA序列，从而实现对基因的修饰。
这个实验通常包括CRISPR/Cas9等基因编辑技术的设计、实现、检测等步骤。
分子生物学相关实验
dNTP
dNTP： 在 PCR 反体系中 dNTP 终浓度高于 50mmol/L 会抑制 Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位臵 启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度 dNTPs 易产生 错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。 PCR 常 用 的 浓 度 为 50 ～ 200μmol/L ， 不 能 低 于 10 ～ 15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓 度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合 成速度，过早终止反应
酶
酶： 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为5U/μl，常用范 围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同， 以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量 过多会导致非特异产物的增加。
退火温度的升高也可以增加反应的特异性。
模板
模板： 单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 的样品。若起始 材料是 RNA ，须先通过逆转录得到第一条 cDNA 。虽然 PCR 可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的 DNA ，但为了保证反应的特异性，还应用 ng 级的克隆 DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片 段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋 白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白。
PCR原理
PCR技术是在模板DNA、引 物和4种脱氧核糖核酸（A、 G、C、T）存在的条件下 依赖于DNA聚合酶的酶促 合成反应。PCR技术的特 异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。
PCR原理
PCR是一种选择性体 外扩增DNA或RNA 片段的方法。此方 法操作简便，可在 短时间内在试管中 获得数百万个特异 DNA序列的拷贝。
……
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溶液稀释与配比C1V1=C2V2：万能稀释公式，一般母液和终浓度比不为X:1用这个公式计算。
X/1：当母液与终浓度比为X：1时用这个快速方法，此时方法为把母液分为1，剩下的用总比例减掉，如：X2（1:1），X6（1:5），X10（1:9）。
百分数和mol数转以1%盐浓度进行转换换设是100克的此溶液，则有99克的水和1克的盐（NaCl），盐的物质的量为1/58.5=0.017mol，水体积为99mL=0.099L，所以物质的量浓度为0.017/0.099=0.17mol/L，即摩尔浓度为0.17mol/L1%=1g/100g (1/58.5)/0.099CTAB法提取DNA1.各成分作用CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；Tris-HCl (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
2.操作步骤打样新鲜叶片，转速220r/min，1min，打样时管身全部冻着，而且放在打样机的时候保证盒子里面得有液氮，这样样品才能充分打碎，写字的朝向一致，以便认字提取1)称取0.1g(约3-4片)新鲜叶片，液氮中研磨成粉末，加入800ulCTAB缓冲液轻轻摇匀，65°C水浴（烘箱）保温30min左右；备注用2ml管提取时，加完CTAB在本子上记录好每个样品的名字，防止后面漏管和裂管时查找被抹掉的号，这样可以防止在侧壁写管的麻烦；在等待的过程时，即可拿出1.5ml离心管加入异戊醇做好准备；写字的朝向一致，以便认字2)冷却（放冰箱）至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）盖上瓶盖，温和摇动，使成乳状液。
备注一定要冷却，不然的话，热涨后盖子盖不紧，此处必须摇匀，不然会因为分层不明显，表面容易起一层油状层；3)（按照管盖的的朝向，在加完异戊醇的管上写上对应样品名字，字迹要大，以防相同的数字出现如81/18，以及即使掉了一些也还有一部分可以识别）4)8000rpm 10min ,离心管中出现三层，小心吸取含有DNA的上清液（400-500ul）到新的1.5ml离心管中。
根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇重复抽提1-2次；备注吸上清液时，按照前面写好的顺序，打开盖，同时打开异丙醇的盖，可以检查哪些漏掉，一旦发现漏掉的，立马盖上盖子，吸完别的后平躺着吸这管吸上清时，枪头不要挨着最深处的上清液，挨着上面那个片层处吸，能吸多少吸多少5)在上清液中，加入0.7倍/等体积的异丙醇（400-500ul），颠倒混匀，放-20入冰箱不少于20min；备注：倒废液时，用空板一排一排倒6)8000rpm 离心10min，弃上清；加600ul的70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，8000rpm 离心5min，除去乙醇，即为DNA粗制品；备注：倒扣在卫生纸上，可以干得更快，40min左右即可拿出，迅速加水溶解，37摇床,67r，1h3.注意事项1)吸取上清液时一定要小心，必要时减掉枪头顶端；2)在倒废液时，找一个管架，盖子打开后朝里侧将其尽量合拢，管口朝外，扣住管架后，一起倒掉废液，这样可以避免液体毁掉管上的字；3)在盖盖时，拇指按住盖，找准方向按下去；碱煮法提DNA试剂0.1moL/L NaOH：4g NaOH，定容至1L1×TE（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0）组分1 M Tris-HCl （pH 8.0）1 ml0.5 M EDTA （pH 8.0）0.2 ml超纯水至100 ml1)1 M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml的配制：称取Tris碱6.06 g，加超纯水40 ml溶解，滴加浓HCl约2 ml调pH至8.0，定容至50 ml。
2)0.5 M EDTA（pH 8.0）50 ml的配制：称取EDTA-Na2·2H2O,9.306 g，加超纯水35 ml，剧烈搅拌，用约1.2g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50 ml。
（EDTA 二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时，才会溶解。
）步骤1.向装有样品的96孔PCR板中，每孔加100μＬ的0.1moL/L NaOH，盖紧配套的硅胶盖，放入PCR仪中，99.9℃加热10min（此步也可在沸水中水浴）。
2.冷却到室温后，快速离心，然后每孔加入100μＬ的1XTE（PH=2.0），盖紧硅胶盖充分混匀并快速离心，上清液即可直接用做ＰＣＲ反应的模板。
RNA提取1磨样（1）编号（冻前写）如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。
（2）磨样（冻钵，持低温，快，细）一定要使材料处于低温状态。
研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！否则会RNA降解得很厉害。
研得细和研得很细，提出的RNA量可以相差几倍！所以，在液氮保护的很好的情况下多研磨几次，要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来！（3）装管（冻管，液装，晚盖）材料一定要有液氮的保护才行。
可以这样做：1、将几个离心管放入一个容器，向容器中加液氮，将其冷冻一下，使之处于低温状态，2、将液氮还未挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。
将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。
PCR扩增1.序列分析1、首先将模板序列在NCBI上做BLAST分析，避开序列的保守位点。
如下图2、如果序列的片段过长，则分段设计引物进行扩增。
因为片段过长会导致中间某些地方扩增不出来，从而导致整个序列扩增不出来。
3、二级结构的分析，有的材料扩不出来需要考虑是否存在2级结构，反向重复，高GC，Poly结构。
这时需要分段设计引物进行扩增与测序。
2.PCR引物设计原则引物设计位置（扩出来）如果是做反向遗传学的话，引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
在做基因组扩增的时候，保证引物特异性的前提下，引物设计的位置最好是在外显子上，因为参考基因组所给的序列只是一个参考，在CDS区域上物种与物种，物种内的都具有较高的保守性，在启动子区域不同的材料之间存在较多的多态性位点。
为了保证引物的有效性，最好是在外显子上设计引物。
引物特异性（扩单一）当引物与所扩片段的其他序列进行错误匹配时，可以导致杂带和目的条带扩增不出来。
另外引物与基因组其他序列进行匹配上也可以导致此问题，这就需要引物设计完成以后，对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
因此在进行引物设计前一定要注意序列的分析。
引物GC含量GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应，GC含量在50%左右比较合适，而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%，另外上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature，寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度），相差不能太大，一般在3℃。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm范围为56-63℃（其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳？）。
Tm过高：引物结合不上去，扩不带，太低引物特异性不好。
引物3′端引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5′末端和相对稳定性较弱的3′，末端如果引物3′稳定性强有可能在即使5′末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩增条带secondary bands 而3′末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸要避开密码子的第3位，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
引物的5′端引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5′末端，这一段有较强稳定性的5′末端称为GC钳，它保证引物与模板的稳定结合。
另外5′末端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能。
形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）引物互补性Hairpin单个引物因为有回文结构会形成十字形结构Dimer单个引物，引物之间可形成局部互补双链5’-ATTTCTTACTGGAG-3’3’-GAGGTCATTCTTTA-5’False priming引物与该条序列上其他位置（或者基因组其他位置）进行错配结合，可以通过序列分析之后进行规避Cross Dimer两条引物之间互配，形成局部双链引物自身不能有连续4个或者分布有较多的互补碱基，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。