植物细胞工程实验 (1)

植物细胞工程

实验一 培养基母液的制备

一、实验目的与意义

学习和掌握培养基母液的配制方法。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

二、实验器材

电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。

三、实验药品

NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。

四、实验步骤

每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制

表1 MS 培养基大量元素母液制备

序号 药品名称

培养基浓度（mg/L ）

扩大20称量(mg)

备注

1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml

2 KNO

3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 4400

4 MgSO 4·7H 2O 370 3700

5 KH 2PO 4

170

1700

各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L 培养基取此液50ml 。

注意：

①配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca 2+、SO 42一

、Mg 2十

和H 2PO 4一

等在一起可能

发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的双蒸水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca 2+、SO 42一

、Mg 2十

和H 2PO 4一

等离子错开混合，速度宜慢，

边搅拌边混合。

②CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。

２、微量元素母液的配制

MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O。按照表2配方，用称感量为0.0001g的电子天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1 L培养基，取微量母液5ml。

表2 MS培养基微量元素母液的配制

序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)

1 MnSO4·4H2O 22.3 2230

2 ZnSO4·7H2O 8.6 860

3 H3BO3 6.2 620

4 KI 0.84 84

5 Na2MoO4·2H2O 0.25 25

6 CuSO4·5H2O 0.025 2.5

7 CoCl2·6H2O 0.025 2.5

注意：

使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。

3、铁盐母液的配制

铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液5ml。

表3 MS铁盐母液的配制

序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)

1 Na2-EDTA 37.3 3730

2 FeSO4·7H2O 27.8 2780

注意：

在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA 应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。

4、有机母液的配制

MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子天平。

注意：

由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度

降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是：配制母液时用无菌双蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。

表4 MS培养基有机物质母液的制备

序号化合物名称培养基浓

度（mg/L）扩大200倍称量(mg)

1 甘氨酸

2 200

2 肌醇100 10000

3 盐酸硫胺素(V B1) 0.1 10

4 盐酸吡哆素(V B6) 0.

5 50

5 烟酸0.5 50

5、激素母液配制

植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：

①配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。

②细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。

③配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。

注意：

所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。

五、思考题：

1、配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl2·2H2O时，为什么要将蒸馏水加热？

2、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。

培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。

表5 按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表