植物细胞工程实验 (1)
专题II 课题1植物细胞工程
3、实现的技术：
植物组织培养技术
就是在无菌和人工控制条件下，将离 体的植物器官、组织、细胞，培养在人工 配制的培养基上，给予适宜的培养条件， 诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完 整的植株。
2.1 植物细胞工程
二、植物细胞工程的基本技术 （一）植物组织培养技术 实验：胡萝卜的组织培养
1、实验原理：
2.1 植物细胞工程
二、植物细胞工程的基本技术 （二）植物体细胞杂交技术 3、过程
二、植物细胞工程的基本技术 （二）植物体细胞杂交技术 3、概念
将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种 细胞，并把杂种细胞培青成新的植物体的技术。
4、成果
番茄一马铃薯（并没有得到预期结果） 烟草一海岛烟草、胡萝卡一羊角芹、白菜一甘蓝等 种间或属间杂种，在生产上有较高的应用价值。 其中"白菜一甘蓝"同普通白菜相比，具有生长期短 、耐热性强和易于贮藏等优点。
2.1 植物细胞工程
二、植物细胞工程的实际应用 （一）植物繁殖的新途径 3、神奇的人工种子
（1）天然种子的不足 ①培育时间长；②易发生性状分离而丧 失其优良特性；③受季节、气候和地域的限 制；④占用大量的土地 （2）人工种子： 就是以植物组织培养得到的胚状体、不定 芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包 装得到的种子。
①分化的植物细胞一般都具有全能性。 ②分化细胞→（脱分化）→愈伤组织→（ 再分化）→胚状体或丛芽→完整植株 ③分化的植物细胞仍具有形成完整植株所 需要的全部基因。
2.1 植物细胞工程
二、植物细胞工程的基本技术 （一）植物组织培养技术
实验：胡萝卜的组织培养 2、实验目的： （1）尝试进行植物的组织培养。 （2）了解植物组织培养的基本原理 3、材料用具：（略）
新教材高中生物第2章细胞工程第1节植物细胞工程教师用书苏教版选择性必修3
第一节植物细胞工程课标内容要求核心素养对接1.阐明植物组织培养技术是利用细胞全能性,在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体等,在培养基上培养,使其发育成部分或完整植株的技术。
2.概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合成为杂种细胞,继而培育成新植物体的技术。
生命观念：通过植物组织培养技术理解细胞的全能性及原因。
科学思维：理解植物组织培养和植物体细胞杂交技术的原理,以流程图形式表示植物组织培养和植物细胞杂交的过程。
科学探究：尝试探究植物生长素和细胞分裂素的使用顺序及比例对植物组织培养的影响。
一、植物组织培养技术1．概念：利用细胞全能性,在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体等,在培养基上培养,使其发育成部分或完整植株的技术。
2．具体步骤选材：外植体：用于植物组织培养的材料如离体的植物器官、组织、细胞或原生质体。
植物的茎尖、根尖、幼嫩的叶片、花药是植物组织培养中常用的外植体。
↓消毒：用消毒剂除去外植体表面的微生物,消毒后的外植体需要用无菌水充分冲洗,以避免消毒剂对外植体的生长、分化过程产生不良影响。
↓接种：无菌条件下,将外植体置于适宜的培养基上的操作。
接种用的培养基一般都要含有适量的水分、无机盐、碳源、氮源、维生素以及植物激素等。
↓诱导脱分化：将已有特定结构和功能的植物组织,在一定条件下,诱导其细胞改变发育途径,逐步失去原有的分化状态,转变为具有分生能力的细胞的过程。
脱分化后形成愈伤组织。
↓诱导再分化：愈伤组织生长一段时间后,将其转移到新的培养基上继续培养,经诱导分化,形成芽和根等器官,或进一步发育成完整植株,也可以诱导形成胚状体。
↓炼苗移植：使分化形成的幼小植株逐渐适应自然环境,保证幼苗移植到大田能顺利成活。
二、植物体细胞杂交技术1．概念：将自发或人工融合的杂种细胞培育成新品种植物体的技术。
2．环节原生质体的制备：酶解法(纤维素酶和果胶酶)去除细胞壁→低速离心分离提纯↓原生质体融合的诱导：化学融合法[聚乙二醇法(PEG)]和物理融合法(电融合法) ↓杂种细胞筛选和培养：两两融合有AA、BB、AB三种类型；融合成功的标志：再生出细胞壁↓杂种细胞脱分化和再分化：技术是植物组织培养,原理是植物细胞的全能性↓杂种植株的再生和鉴定3．应用实例白菜—甘蓝、萝卜和甘蓝、烟草和番茄、马铃薯和番茄、水稻和稻稗。
植物细胞工程设计性实验
综合实训实验内容：每个小组选择一种植物为研究对象，提交研究方案、设施方案、结果总结，最终提交研究报告。
【目的】：进一步培养和提高学生思维能力、动手能力、分析问题和解决问题能力。
【要求】：用于试验设计的题目按照指导教师的要求任选。
要求学生独立完成试验设计和整个试验操作过程，并完成试验总结报告。
1植物培养研究方案的制订实验目的：培养学生查阅收集资料的能力，综合运用所学知识组织文字写出研究方案。
实验内容：1.1 网上、图书资料室收集查阅资料的方法。
1.2 制订方案的撰写方法①前言综述国内外与本研究领域有关的研究动态：包括取得的成就、存在的问题和进一步研究要解决的问题，提出进行本试验设计的方法及其研究的目的和意义。
②研究的材料和方法设计③观察的项目④预期的进度1.3实施研究方案的试验研究中注意的事项实验方法：课堂讲授，学生和老师讨论。
作业：选择一种植物为研究对象，在一周内写出小组的研究方案，交电子档案。
方案提交举例：例如：1.研究对象芥蓝Brassica albograbra2.设计内容2.1综述国内外与本研究领域有关的研究动态2.2 试验研究内容2.2.1试验材料实验材料选取的品种2.2.2外植体来源和消毒处理外植体采用由无菌苗得到的子叶和下胚轴切段。
2.2.3培养基设计2.3试验研究拟采取的实施方案和技术路线2.3.1拟采取的实施方案2.3.1.1 愈伤组织的诱导2.3.1.2诱导生芽2.3.1.3 根的诱导2.3.2 技术路线（框图）2 实验小组研究方案的实施实验目的：让学生在开放性实验室中做试验研究，完成自己的研究方案，在研究中熟练和掌握植物组培的全部技术过程，争取研究成功培养出植物组培苗。
实验内容：学生完成自己的研究方案实验方法：实验室完全开放给学生使用(钥匙给学生)，建立开放实验室的管理制度，让学生自由做实验研究。
上课时间指导老师到位，指导学生和给学生解决所需的比较特殊的试剂、仪器、用品等。
植物细胞工程理论课内容(1)
目录（共十一章，包括绪论）绪论第一章实验室设备和一般技术第二章培养基及其配制第三章外植体的选择和灭菌第四章外植体的接种和培养第五章愈伤组织的培养第六章营养器官培养第七章植物快速繁殖和脱毒第八章细胞培养第九章原生质体培养和体细胞杂交第十章种质保存参考书目：请链接参考书目./v_playlist/f1461876o1p7.html（优酷网上的视频请插入到绪论中）绪论知识点：1.掌握植物细胞工程的概念及相关的专有名词2.理解细胞全能性理论3.掌握植物细胞离体培养发生的途径4.了解植物细胞工程的应用一．植物细胞工程（plant cell engineering）概念植物细胞工程是指植物在细胞水平上进行的遗传操作。
其相关的理论和技术主要是：植物生理学、细胞生物学和分子生物学等。
植物组织培养（plant tissue culture）:在无菌条件下将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体培养在人工配制的培养基上，人为控制培养条件，使其生长、分化、增殖发育成完整植株或生产次生代谢物质的过程和技术，也叫离体培养（in vitro culture）相关的专有名词：外植体（explant）：从植物体上切取下来用以培养的材料。
愈伤组织(callus)：由外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。
继代培养(subculture)：由最初的外植体上切下新增殖的组织，继续转入新的培养基上培养的过程。
胚状体(embryoid)：在离体培养过程中，起源于非合子，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚的细胞群。
分化(differentiation)：导致细胞或组织形成不同结构并引起功能或潜在发育方式改变的一种过程。
脱分化(dedifferentiation)：原已分化的细胞失去原有的形态和机能，又回复到没有分化的无组织的细胞团或愈伤组织的过程。
再分化(redifferentiation)：由脱分化状态的细胞再度分化形成另一种或几种类型的细胞的过程。
植物细胞工程的操作方法
植物细胞工程的操作方法
植物细胞工程是利用组织培养和转基因技术等手段，对植物细胞进行操作和改造的过程。
下面是一些常见的植物细胞工程操作方法：
1. 组织培养：从植物体中取出胚或幼嫩组织，进行无菌处理后，放入培养基中进行培养。
培养基的成分要根据具体的实验目的而定。
培养过程中需要定期观察和维护，以保证细胞的正常生长和分化。
2. 愈伤组织诱导：通过培养基中添加适量的激素，如植物生长激素（如激素2,4-D、NAA等）或激素抑制剂（如抗生素或乙烯利等），诱导植物细胞形成愈伤组织。
愈伤组织通常可以通过悬浮培养、固体培养或液体培养等方式来进行培养和增殖。
3. 基因转化：通过利用适当的载体将目标基因导入到植物细胞中，使其表达或抑制目标基因的功能。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
4. 基因筛选和分析：转基因植物细胞经过转化后，需要进行基因筛选和分析。
常见的筛选方法包括PCR扩增、Southern blotting、Western blotting等。
这些方法可用于验证目标基因是否成功导入，并分析其在转基因植物细胞中的表达水平和功能等。
5. 再生植株的培育：将经过基因转化的细胞或组织进行培养和分化，促进其再
生为完整的植株。
这一过程通常需要进行适当的生理调控和培养条件的优化，以提高再生植株的成功率。
需要注意的是，植物细胞工程是一门复杂的科学技术，不同的实验目的和植物种类可能需要采用不同的操作方法和技术路线。
此外，在进行植物细胞工程实验时，还要注意严格遵守相关的生物安全规范和伦理要求。
人教版高中生物选择性必修第3册 基因工程 植物细胞工程(1)
以培育番茄-马铃薯的杂种植株为例，解决植物体细胞杂交过程中的问题
1. 要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起遇到的第一个障碍是什么？如何解决？
酶解法去除细胞壁
2.若两种原生质体混合在一起，就能融合形成一个细胞吗？
基于细胞膜的流动性，介绍物理方法和化学方法
3.仅考虑两两融合的情况，融合细胞有几种类型？
3.通过解决番茄-马铃薯杂种植株育种过程中的问题，说出植物体细胞杂交的原理和意义。
教学重点
1.植物组织培养的原理和过程。
2.植物体细胞杂交的原理和意义。
教学难点
植物组织培养的过程
教学过程(表格描述)
教学环节
主要教学活动
设置意图
导入
北京市花月季为例，提出花卉快速大量繁殖的难题。
联系生活生产，创设真实情景。
植物组织培养
先回顾必修一斯图尔德的胡萝卜组织培养实验，然后介绍组织培养的过程，以及相关名词
展示植物组织培养的过程，学生先对其过程有一个整体的认识。
以植物组织培养的发展历程为线索
1902年哈勃兰特提出细胞全能性的假设，并设计实验验证假设，分析实验失败的原因；
1934年，植物生长素发现，生长素使山毛柳形成层细胞分裂旺盛；
1955年，发现激动素，激动素可以促进芽的形成；
1957年，Skoog和Miller提出有关植物激素控制器官形成的概念，展示烟草和菊花的植物组织培养实验，分析实验结果，得出结论：高细胞分裂素、低生长素有利于芽的形成，高生长素、低细胞分裂素有利于生根，生长素和细胞分裂素比例适宜有利于愈伤组织产生。
1958年，斯图尔德的胡萝卜植物组织培养实验成功，首次验证了植物细胞的全能性。
小结
植物组织培养技术，植物体细胞杂交技术的总结。
胡萝卜愈伤组织培养实验报告
植物细胞工程-胡萝卜的组织培养姓名：物理数学狂班级：生物技术综合班学号：2019004284【实验计划】1.MS培养基母液的配置与保存、MS固体培养基的配置（准备实验）2.外植体胡萝卜愈伤组织的诱导培养（2018.10.18）3.胡萝卜愈伤组织的继代培养（2018.11.8）4.胡萝卜愈伤组织悬浮培养（2018.11.22）5.胡萝卜愈伤组织诱导生根（2018.12.1）6.观察实验结果（2018.12.13）【实验时间】2018年10月18日-2018年12月13日实验（一）MS 培养基母液的配制与保存一、实验目的1.通过MS 培养基母液的配制，掌握配制培养基母液的基本技能；2.掌握培养基各种母液的保存方法。
二、实验原理1.MS 培养基的特点：①无机盐浓度高；②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；③含有一定的铵盐，营养丰富；④不需要添加更多的有机附加物。
MS 按照营养水平划分为基本培养基。
2.培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养物质，配置培养基时，为了减少试剂称取时的工作量出现的误差，以及多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，需要预先将各种营养成分配置为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到适合的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。
3.需要时将配置好的母液按一定比例稀释到培养基指定浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调解物质等，制成符合要求的培养基。
三、器材与试剂1.器材：各类天平、磁力搅拌器、冰箱、烧杯、量筒、玻璃棒、试剂瓶、标签；2.试剂：95%酒精，0.1-1N NaOH ，0.1-1N HCl ，配制MS 培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。
四、方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。
优点：（1）保证各物质成分的准确性；（2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。
1.MS 大量元素母液（10×）称10升量溶解在1升蒸馏水中。
植物细胞工程实验过程
实验一：配置MS 培养基实验二：黄瓜种子的消毒与萌发每小组20粒种子→75%酒精30s →10%次氯酸钠20min →无菌水冲洗3～4次→接入黄瓜种子萌发培养基中实验三：烟草叶片的消毒和接种 流水冲洗→75%酒精30s →10%次氯酸钠5~20min →无菌水冲洗3～4次——————→切块（0.7cmx0.7cm ）3~5块/瓶→接种到8种配方的培养基（1）MS+2，4-D 0.5mg/L（2）MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 0.5mg/L（3）MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L（4）MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L（5）21MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+0.2%AC （活性炭） （6）MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L（7）MS+6-BA 2.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L（8）21MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L 发根农杆菌介导的黄瓜子叶转化发根农杆菌培养→测OD 值→加入黄瓜子叶切块浸泡10min （切两端，留中间） →吸干多余菌液→接入MS 培养基中→共培养2d （暗培养） →抑菌选择培养（含cef 的MS 培养基）实验四：黄瓜毛状根的筛选培养切下能在无激素培养基上自主生长的黄瓜毛状根 →不同浓度卡那霉素的MS+cef 培养基实验五：继代培养第一组：转到3,5,6,8号配方培养基中培养第二组：转到1,2,7号配方培养基培养第三组：转到1,2,3,5,7号配方培养基培养第四组：转到4,5,6号配方培养基第五组：转到4号配方培养基第六组：转到1,4,8号配方培养基第七组：转到1,2,6,7号配方培养基第八组：转到 吸水纸吸干。
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植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
二、实验器材电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。
三、实验药品NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。
四、实验步骤每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制表1 MS 培养基大量元素母液制备序号 药品名称培养基浓度（mg/L ）扩大20称量(mg)备注1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml2 KNO3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 44004 MgSO 4·7H 2O 370 37005 KH 2PO 41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。
后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。
到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。
配制培养基时，每配1L 培养基取此液50ml 。
注意：①配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca 2+、SO 42一、Mg 2十和H 2PO 4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。
为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的双蒸水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。
特别应将Ca 2+、SO 42一、Mg 2十和H 2PO 4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。
②CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。
另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。
２、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。
微量元素用量较少，特别是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O。
按照表2配方，用称感量为0.0001g的电子天平称量，其它同大量元素。
配制培养基时，每配制1 L培养基，取微量母液5ml。
表2 MS培养基微量元素母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1 MnSO4·4H2O 22.3 22302 ZnSO4·7H2O 8.6 8603 H3BO3 6.2 6204 KI 0.84 845 Na2MoO4·2H2O 0.25 256 CuSO4·5H2O 0.025 2.57 CoCl2·6H2O 0.025 2.5注意：使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。
3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。
目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。
这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。
配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。
配制培养基时，配制1L取此液5ml。
表3 MS铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1 Na2-EDTA 37.3 37302 FeSO4·7H2O 27.8 2780注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。
为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA 应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。
4、有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。
培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。
配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子天平。
注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。
被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。
避免此现象发生的方法是：配制母液时用无菌双蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。
表4 MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大200倍称量(mg)1 甘氨酸2 2002 肌醇100 100003 盐酸硫胺素(V B1) 0.1 104 盐酸吡哆素(V B6) 0.5 505 烟酸0.5 505、激素母液配制植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。
一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：①配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。
②细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。
③配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。
注意：所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。
五、思考题：1、配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl2·2H2O时，为什么要将蒸馏水加热？2、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。
培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。
表5 按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表实验二培养基的配制与灭菌一、实验目的与意义学习培养基配制与灭菌的操作方法。
对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。
不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。
另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。
培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。
二、实验器材电子天平、烧杯（1000ml）、医用搪瓷量杯（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。
三、实验药品蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、HCl、各种培养基母液。
四、实验步骤（一）、培养基配制（以1L MS培养基为例）1、计量根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）×1000 ml/母液浓度（mg/L）。
2、移液取医用瓷一只，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷缸中备用。
注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。
②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。
③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错；④移液管不能混用。
3、称取称取7g琼脂，30g蔗糖备用4、融化用搪瓷杯量取600～700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。
注意：在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。
此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。
但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。
5、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。
6、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2～0.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.2～0.5个单位左右)。
注意：调配时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。
7、分装溶化的培养基应该趁热分装。
分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或100 ml)中。
注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。
锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。
每1L培养基，可分装25～30瓶。
8、包扎用封口膜封口，扎好绳子，用记号笔做好标记注意：培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。
避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值，一般不低于5.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量。
（二）培养基的灭菌培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。
而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。
因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。
常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。
1、高压蒸汽灭菌法把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。
盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。
加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm2时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。
当指针移至1.1～1.2kg/cm2时，即121℃时，维持一定的时间。
由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。
取出培养基，待培养基自然冷却凝固。