激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用
激光扫描共聚焦显微镜及其在生物医学中的应用
自动将荧光图像与透射光图像重叠以显示荧光在形态结构
［)］ 上的精确定位 ， 可以准确检测抗原表达、 荧光原位杂交斑
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激光共聚焦显微镜的应用模式
单一光切片模式 光切片是 "#$% 最基本的成像单元， 在水平方向对一定
点及细胞结合和杀伤的形态学特性。
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激光共聚焦显微镜在生物医学中的应用
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激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用
第36卷第1期Vol.36 No.l 2021年02月Feb. 2021汕头大学学报(自然科学版)Journal of Shantou University (Natural Science)文章编号：1001 - 4217(2021 )01 - 0076 - 06激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用张冰娜*,叶丹彦，张丹桂，李璐，杨旅军（汕头大学医学院第二附属医院转化医学研究中心，广东汕头515041）摘要文章探讨激光共聚焦扫描显微镜技术在检测低氧诱导小鼠心肌细胞损伤自噬小体 变化的应用价值.在无菌条件下，取胚胎型小鼠心肌细胞备用.采用低氧环境+缺氧液方法 诱导心肌细胞损伤并发生自噬现象作为实验组，正常环境下培养细胞的方法作为对照组.待 心肌细胞长到一定程度后，分别利用激光共聚焦扫描显微镜和正置荧光显微镜对免疫荧光 染色的自噬小体表达的LC3A/B 蛋白情况进行观测并比较2种检测方法的优缺点.结果显示 利用低氧环境+缺氧液方法诱导小鼠心肌细胞损伤并自噬小体形成是可行的.与正常对照组 比较，低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损伤组（实验组）自噬小体呈高表达状态.与普通型正置荧 光显微镜比较，激光共聚焦扫描显微镜成像速度快，一次可以获得多副图像且图像清晰.激 光共聚焦扫描显微镜技术具有成像速度快、灵敏度高和精确度高等优点，可以实时、准确 观测低氧诱导小鼠心肌细胞损失自噬小体的表达情况,具有重要临床应用价值.关键词激光共聚焦扫描显微镜；正置荧光显微镜；自噬小体中图分类号TN24 文献标识码A心血管疾病是世界范围内危害人体健康的重要疾病，其中心肌梗死是心血管疾病的 最常见疾病之一•在中国，心血管疾病的发病率和死亡率逐年升高，且呈现年轻化趋势, 严重危害着人们的健康，给社会和家庭带来了巨大的经济和精神负担•研究报道叫心 肌细胞损伤时细胞自噬参与疾病的整个过程并发挥着重要作用•细胞自噬（autophagy ）是 指细胞应对外部环境变化时的一种代谢方式，在基础状态下自噬水平较低，用于维持内 环境的稳态和细胞存活；在缺血缺氧条件下，细胞能量或营养供应不足，导致细胞自噬 被显著激活，激活的自噬小体可用于清除损坏的细胞器或侵入的病原体，广泛参与各种 病理生理过程玖然而，其他研究指出缺血再灌注导致的细胞自噬过度激活，不利于心 肌细胞存活网因此，准确观测细胞自噬小体的变化情况对于理解心肌损伤机制并及时 作出正确干预具有重要临床意义•目前,普通型正置荧光显微镜由于其高分辨率被广泛用于对样品结构和组成成分进 行定位和定性检测•然而，正置显微镜技术存在成像速度慢、精确度有限及荧光散射伪收稿日期：2020-09-23作者简介：张冰娜（1988-）,女（汉族），广东汕头人，助理实验师.研究方向：医学生物细胞学.E-mail : 120853641********.基金项目：高水平大学建设计划临床医学重点建设学科专项资金（粤教科函（2018）181号）第1期张冰娜等：激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用77影重等不足.激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,LCSM)作为一种先进的细胞分析仪器，具有高精确度、高分辨率、高灵敏性以及高放大倍数等特性,可以在细胞层面对样本进行断层、逐点、逐行和逐面等快速扫描成像，在生物医学中具有广泛应用价值叫因此，本研究旨在利用激光共聚焦扫描显微镜技术检测低氧诱导小鼠心肌细胞损伤自噬小体变化情况.1材料与方法1.1主要仪器和试剂仪器：激光共聚焦扫描显微镜(LeicaTCSSPE),正置荧光显微镜(OLYMPUS BX51).试剂：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(美虱Gibco),0.25%胰蛋白酶，1倍的磷酸盐缓冲液(PBS).细胞：胚胎小鼠心肌细胞.1.2低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成将小鼠心肌细胞消化后接种于铺有盖玻片的六孔板中.待细胞长至80%,低氧诱导组换成缺氧液，于1%02和5%CO2三气培养箱培养3h后复氧1h.1.3免疫荧光染色将低氧缺氧诱导组和对照组的培养基去除干净，PBS洗3次，3min/次.加入4%多聚甲醛固定20min,PBS洗3次，3min/次.加入0.1%TritonX-100透化15min,PBS 洗3次，3min/次.加入山羊血清工作液封闭20min,去除血清，加入稀释的LC3A/B 一抗(1:250,Cell Signaling Technology#4180)4°C孵育过夜.用PBS洗3次，3min/次，避光加入稀释的山羊抗兔荧光二抗(1：500,碧云天，Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG (H+L))37WWlh,用PBS洗3次，3min/次，加入DAPI工作液细胞核衬染(碧云天，Irving Blue(0.5%,SIGMA)细胞浆衬染，PBS洗净后，镜检.(见表1)表1免疫荧光染色结果低氧缺氧诱导组对照组低氧缺氧对照组氯唾抑制阳性组正常阴性组诱导组氯唾抑制阳性组正常阴性组一抗+++---二抗+++++4-注：低氧缺氧诱导组为实验组，氯摩抑制组作为阳性对照组，未做任何处理的正常细胞作为阴性对照组；+为加入抗体，_为不加入抗体1.4应用激光共聚焦扫描显微镜和正置荧光显微镜对图片进行采集激光共聚焦扫描显微镜(Leica TCS SPE)采集：Alexa Fluor488激光激发波长：480〜495nm；Irving Blue激光激发波长：543~575nm；DAPI激光激发波长359nm.同时采集绿色、红色、蓝色以及三色叠加图•正戦光显微镜(OLYMPUS BX51)采集：选择荧光滤镜：1-DAPI、2-FITC,3-Rhod,78汕头大学学报（自然科学版）第36卷分别采集蓝色、绿色、红色图像，然后通过软件将3图进行合并.2结果2.1低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬小体形成细胞在氯座抑制下出现了明显的自噬小体•利用低氧环境+缺氧液方法诱导小鼠心肌细胞损伤并自噬小体形成是可行的•与正常对照组比较，低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损伤组自噬小体呈高表达状态.2.2正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况的差异正置显微镜和激光共聚焦显微镜检测自噬小体表达情况如图1（见封3）.自噬小体分泌的抗原可以与Alexa Fluor488标记的LC3A/B抗体结合，呈现绿色；DAPI衬染细胞核为蓝色；Irving Blue衬染细胞浆呈红色；3者叠加图（Merge）可清晰观察自噬小体在心肌细胞内的位置及表达情况•与正置显微镜比较，激光共聚焦显微镜成像速度快，图像清晰及灵敏度高.3讨论细胞自噬是真核细胞内一种非常重要的生理过程，主要通过亚细胞膜结构的变化并经溶酶体介导对细胞内的细胞器、蛋白质和膜磷脂进行降解，维持细胞合成和代谢的平衡，进而维持细胞内环境的稳定•本实验结果发现低氧缺氧诱导小鼠心肌细胞损失可以引起自噬小体高表达，与既往类似研究适度刺激引起的细胞自噬作用对缺氧心肌细胞具有一定保护作用的结果基本一致旦细胞自噬起始于自噬小体的形成，当细胞自噬被激活时，自噬小体表达的LC3发生膜型转化，主要分布在细胞膜上；细胞自噬未被激活时，LC3仍停留在细胞浆内，呈散在块状分布阿现在普遍观点认为,在心肌病变早期细胞自噬被认为是一种保护性机制•然而，有研究指出过度激活细胞自噬，不利于心肌细胞的存活孔因此，快速准确检测细胞自噬时自噬小体的表达情况对于指导临床干预具有重要应用价值.免疫荧光法是目前检测自噬小体的常用方法，主要仪器包括普通正置荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜•普通正置荧光显微镜由于操作方便、费用低和仪器比较普遍等特点被广泛应用于实验研究•然而，正置荧光显微镜在使用过程中只能局限于单个波长拍照，之后再合并不同通道的图像，存在成像速度慢等缺点.另外，正置荧光显微镜会随着次级荧光的干扰，使图像清晰度下降，同时也会受曝光时间、增益影响，出现不同荧光染料的交叉干扰，无法在需要高灵敏度的实验中获取精确图像叫除此之外，正置荧光显微镜需要人肉眼观察得出结果，存在主观因素的干扰，无法客观准确地对自噬小体的位置和含量进行评估.激光共聚焦扫描显微镜作为一种先进的荧光成像技术，主要利用激光作为扫描光源，采用光源针孔与检测针孔共辄聚焦技术，对样本进行快速的点、线或二维图像成像R叫由于激光束的波长较短，光束很细，其分辨率大约是普通光学显微镜的3倍.另外，激光共聚焦扫描显微镜不仅可以通过多通道荧光捕获技术同时第1期张冰娜等：激光共聚焦扫描显微镜观测自噬小体变化的应用79获取多标记荧光图像，减少多色荧光之间的波段叠加，抑制图像的模糊；还可以与其他多种先进技术兼容达到联合应用的目的叫总之，激光共聚焦扫描显微镜已成为分子生物学、形态学、细胞学、药理学和遗传学等领域强有力的研究工具.随着科学研究的不断深入，激光共聚焦扫描显微镜在细胞结构㈣、核酸及蛋白质问、细胞内自由基活性四、细胞内钙离子浓度变化问、膜电位网等生命科学研究中发挥重要的作用•近年来，新开发的高速活细胞双转盘式共聚焦系统进一步提高了检测的灵敏度、图像的采集速度，同时降低了光毒性•因此，激光共聚焦扫描显微镜具有检测速度快、灵敏度高、定位精确和多色荧光成像等优点，可以直接探测活细胞在化学因子、细胞因子或激素等作用下所致的离子细微动态变化,是目前检测自噬小体变化的最为先进仪器之一.参考文献[1]李伟愍，自噬增强对缺氧心肌细胞活性的影响[J].中国现代药物应用，2020(15)：242-244.[2]WANGM,LI Y J,DING Y,et al.Silibininprevents autophagic cell death upon oxidative stress in corticalneurons and cerebral ischemia-reperfusion询ury卩].Mol Neurobiol,2016,53:932-943.⑶曹原，沈涛，黎健，应激状态下的心脏自噬：自噬作用是有益还是有害？[J].生理科学进展，2015(4)：309-313.[4]武美娜，李新毅，白玮，等.激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用[J].中国药物与临床，2008(7)：530-532.[5]浦延鹏，周佳明.当归挥发油对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞H9C2自噬的调控作用研究[J].中国药房，2020(31)：2492-2497.[6]杨侃，李晓宁，GIDEON O,等.一种优化小鼠成纤维细胞中自噬小体示踪的方法[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2017,26(1)：65-71.[7]于湘华，刘超，柏晨，等.光片荧光显微成像技术及应用进展[JJ.激光与光电子学进展，2020(57)：9-23.[8]ADRIANA IM,CONSTANTIN C,MIHAI L,et al.Current and future applications of confocal laserscanning microscopy imaging in skin oncology[J].Oncology letters,2019,17(5)：4102-4111.[9]郑易，楼永良.激光扫描共聚焦显微镜技术在医学院校创新型实验教学中的应用[J].温州医科大学学报，2020,50(10)：859-860.[10]吴伟全，王思捷，李元歌，等.激光扫描共聚焦显微镜及透射电镜观察肺癌A549细胞亚细胞结构溶酶体的对比分析[J].临床医学工程，2013(6)：666-66&[11]杨怡姝，王小利，沈思嗣，等.激光扫描共聚焦显微镜原位检测核酸及蛋白质的实验教学设计[J].实验技术与管理，2011,28(2)：58-60.[12]廖钢陵，吴元德.超氧阴离子自由基对大鼠肝卵圆细胞胞内自由钙浓度的影响[J].基础医学与临床，2000(4)：79-81+90.[13]刘洋，王丽婷，冉海莹，等.激光共聚焦显微镜检测双酚A损伤精母细胞后钙离子的浓度变化[J].科学咨询(科技•管理)，2017(23)：60-61.[14]林元相，徐如祥，姜晓丹，等.激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化[J].中国临床康复，2006,10(17)：45-48+195.80汕头大学学报（自然科学版）第36卷Application of Laser Confocal ScanningMicroscope in Observing AutophagyZHANG Bingna,YE Danyan,ZHANG Dangui,LI Lu,YANG Lvjun(Research Center of Translational Medicine,Second Affiliated Hospital ofShantou University Medical College,Shantou515041,Guangdong,China)Abstract To investigate the application value of laser confocal scanning microscopy(LSCM)in detecting the changes of autophagy bodies in hypoxic-induced myocardial injury in mice.Under aseptic condition,cardiomyocytes of embryonic type mice were taken for standby.The experimental group was treated with hypoxic environment and hypoxia solution to induce myocardial cell injury and autophagy,and the control group was cultured in normal environment.After the cardiomyocytes grew to a certain extent,the LC3A/B protein expression of autophagosome was observed by laser confocal scanning microscope and forward fluorescence microscope,respectively. The advantages and disadvantages of the two methods were also compared.It is feasible to induce myocardial cell injury and autophagy in mice by hypoxia environment and hypoxia pared with the normal control group,the autophagy of the mice myocardial cell injury group(experimental group)was highly pared with the normal fluorescent microscope,the laser confocal scanning microscope has a fast imaging speed,and can obtain multiple images at a time and the image is ser confocal scanning microscope has the advantages of fast imaging speed,high sensitivity and high accuracy.It can be used to observe the expression of autophagy in mice cardiomyocytes induced by hypoxia in real time and accurately,and has important clinical application value.Keywords laser confocal scanning microscope;fluorescence microscope;autophagosomes8正置荧光显微镜Irving BlueLC3A/BDAPI Merge(A)激光共聚焦显微镜LC3A/B Irving BlueDAPI Merge(B)（A）正置显微镜在（40x10）倍时显示自噬小体欠清晰；（B）激光共聚焦显微镜在（40x10）倍时可清晰显示自噬小体在细胞内的位置及含量变化。
采用激光共聚焦显微术研究大鼠视神经细胞的空间结构
采用激光共聚焦显微术研究大鼠视神经细胞的空间结构激光共聚焦显微术（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨显微成像技术，应用非常广泛。
在生物医学领域里，LSCM被广泛用于分析各种不同类型的细胞形态和结构，尤其是神经元和神经元网络的形态构造，新陈代谢活动及局部分布的微环境。
在研究大鼠视神经细胞的空间结构和功能方面，LSCM是一项特别有用且有效的成像技术。
LSCM扫描方式通过聚焦高功率激光束，将细胞或组织成像并用光学器件收集产生的荧光信号，随着显微镜小孔的扫描，可以在横截面上地重建细胞空间结构，三维实体内部的显微成像。
这种高分辨技术就足以将细胞细小的亚结构、细胞类型、分子运动和元素的分布清晰地呈现出来，同时可以提供令人惊叹的时间分辨图像，从而使组织学家和细胞学家获得高分辨的空间动态成像技术来研究神经元的复杂运作。
大鼠视神经是连接眼球和大脑的，车轴体和轴突形成的头部神经的一条。
视神经是传输视觉信息的主要路径之一，在神经科学和眼科生物医学领域，对视神经的研究一直受到广泛的关注。
现代医学的发展，使得我们能够对视神经进行非常细致的分析，然而，收集这些信息的方法仍然考验着科学家的能力。
LSCM在神经科学研究中的应用，尤其是在研究视神经的空间结构中发挥了重要作用。
神经元感受信息并在神经元细胞的轴突上传递信息，我们知道轴突的空间结构对于信息传递和整合具有重要作用，因此研究神经元空间结构可以更好地理解神经元的整体功能。
大鼠视神经分布着许多神经元细胞，其中的结构和功能复杂多样。
因此，使用LSCM技术，可以通过3D实体成像技术，详细呈现出这些神经元细胞细微的结构，从而更好地研究它们的运作。
从LSCM图像中，可以获得大量分辨率较高的显微图像，从而获得大量的神经元亚结构信息。
利用线探针针对神经细胞进行染色后，通过LSCM可以建立3D数字模型，更好地理解神经元空间结构与运作的关系。
共聚焦激光扫描显微镜及其在神经科学研究中的应用
共聚焦激光扫描显微镜及其在神经科学研究中的应用庄正飞;刘智明;郭周义;刘颂豪【期刊名称】《中国医学物理学杂志》【年(卷),期】2011(028)001【摘要】目的:共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)是一种新兴的显微图像检测技术,能够进行光学切片、活体检测、三维重构等,并且能够获得较之普通光学显微镜更高的空间分辨率.本文旨在讨论CLSM及其在神经科学中的应用.方法:通过大量调研文献,从细胞、亚细胞及分子水平上详细阐述了CLSM在神经科学领域中的应用.结果:相比传统光学显微镜,CLSM更适合在神经科学的细胞等层次上进行成像和活体观测试验.结论:CLSM 作为一种精密的观察工具,已广泛应用于神经科学研究,为推动神经科学的发展做出了贡献.新的双光子共聚焦显微镜由于其自身的优点在神经科学研究中将具有很大的发展空间.【总页数】4页(P2441-2443,2451)【作者】庄正飞;刘智明;郭周义;刘颂豪【作者单位】华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631;华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631;华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631;华南师范大学,生物光子学研究院,广东,广州,510631【正文语种】中文【中图分类】Q-3【相关文献】1.激光共聚焦显微镜在神经科学研究中的应用 [J], 王有琼;郑晓克;张海鹏;杨小晓;乐亮2.认知神经科学研究中神经功能成像和神经电生理技术的应用进展 [J], 刘超;韩建阁3.共聚焦激光扫描显微镜技术在研究大鼠海马神经元胞内钙超载中的应用 [J], 黄娅林;赵鹏;程介士4.膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用 [J], 朱海军;丁冲;徐桂芝5.弥散张量成像在语言认知神经科学研究中的应用 [J], 乐秋海;舒华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
激光扫描共聚焦显微技术及其在神经、肿瘤相关研究中的应用
激光扫描共聚焦显微技术及其在神经、肿瘤相关研究中的应用张鹏;毕明刚【摘要】介绍了近年来新出现的共聚焦显微镜新的种类,如传统激光共聚焦和活细胞激光共聚焦,对其功能及在神经、肿瘤研究中的应用进行了综述,使现代显微镜能够更加深入研究和分析细胞的变化过程和结构.活细胞激光扫描共聚焦显微镜与双光子激光扫描共聚焦显微镜实现了对肿瘤、神经活细胞长时间地动态观测,可更加真实地揭示细胞凋亡的机制与规律.【期刊名称】《医疗卫生装备》【年(卷),期】2010(031)002【总页数】4页(P43-45,49)【关键词】激光扫描共聚焦;基因敲除;活细胞检测;凋亡【作者】张鹏;毕明刚【作者单位】150076,哈尔滨,啥尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站;中国医学科学院药用植物研究所【正文语种】中文【中图分类】TH742.1激光扫描共聚焦显微镜经过30 a的发展已被广泛应用于形态学、分子生物学、神经科学、肿瘤药理学、遗传学等领域。
由最初的单一激光扫描共聚焦显微镜发展到现在的双光子共聚焦显微镜、多光子共聚焦显微镜、活细胞共聚焦显微镜等多种显微镜，以适应不同功能需要，为生命科学提供了更加有效的定性定量的细胞测量工具。
激光扫描共聚焦显微镜尤其在研究细胞凋亡机制和神经疾病相关蛋白定位中发挥着重要作用，通过激光共聚焦显微镜可检测到与神经疾病相关的蛋白分布情况，以及肿瘤细胞中各种凋亡相关蛋白表达的变化。
激光共聚焦显微镜在一定程度上推动了神经科学及抗肿瘤药物作用机制的研究。
下面仅对近年来新出现的共聚焦显微镜新的种类、功能及其在神经、肿瘤研究中的应用进行简要综述。
1 激光扫描共聚焦1.1 传统激光共聚焦激光共聚焦显微镜技术已经成为光学显微镜发展应用中最重要的一种手段。
在常规的宽视野光学荧光显微镜中，样本发射的继发性荧光在物镜焦平面上黯淡不清[1]，使一些细节丢失。
共聚焦显微镜改善了中轴（Z轴:平行于显微镜视轴）和侧平面（X轴和Y轴:样品平面的维度）的光学分辨率，并且能够减少在成像过程中由样品在焦平面中产生的继发性荧光。
成年大鼠心肌细胞高效激光共聚焦显微镜钙成像方法
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中 国现 代 药 物应 用 ２ ０ １ ３年 ４月 第 ７卷 第 ８期
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激光共聚焦显微镜的使用和应用
激光共聚焦显微镜的使用和应用激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种在生物医学领域应用十分广泛的高分辨率显微镜技术。
相比传统的荧光显微镜，LSCM独特的成像原理和功能使其在细胞生物学、生物医学研究以及材料科学等方面具有非常重要的应用。
LSCM使用的原理是激光扫描和共聚焦。
首先，通过激光光源发出的单色激光束照射样品，并经过镜片的调焦使得激光聚焦于单个样品点上。
样品中的物质吸收或发射荧光，在共焦点由反射镜反射回来，进入到光学检测系统中，并通过光学系统传达给光电倍增管，再由电信号转换为图像信息。
通过光学透镜逐点扫描整个样品，构建出样品的二维或三维图像。
LSCM相比传统显微镜具有以下几个优点：1.高分辨率：借助共焦技术，可以消除背景杂乱的荧光，只能检测到焦点附近的物质，因此在图像质量上表现出非常高的分辨率。
2.光学切片：可以通过调整镜片的焦距，只聚焦在感兴趣的层面上，可以在三维空间内获得细胞、组织的立体结构信息。
3.高亮度和低光毒性：由于采用单光子激发方式，LSCM提供了高亮度、低光毒性和低伤害的成像模式，可以更好地保护生物样品。
LSCM在生物医学领域的应用非常广泛：1.细胞观察与研究：LSCM可以观察到细胞的三维结构、蛋白质、DNA、RNA等生物分子标记，并通过共焦显微镜的三维成像技术，对细胞内的致病因子和细胞的活动过程进行实时观察和分析，从而揭示细胞的功能和机制。
2.分子定位和交互：通过标记荧光分子，LSCM可以实现对分子在细胞内的定位和相互作用的观察，如蛋白质的定位、互作关系等。
通过这些观测，可以更好地了解分子间的相互作用以及其在细胞功能和疾病发展中的作用。
3.组织学研究：LSCM在组织学研究中可以提供更高分辨率的图像，可以观察到组织的细胞构成、细胞外基质和多种细胞标志物等。
这对于了解组织结构与功能的关系，以及细胞增殖、细胞死亡等生理过程具有重要意义。
激光共聚焦显微镜在神经科学研究中的应用
共 聚焦 图像 是标 本 的光 学横 断 面 ，具 有 光源方 向性 强 、发散 小 、亮 度高 、高度 的空 间和 时间相 干性 以及 平 面偏 振激 发等 独特 的优点 ，克服 了普 通 显微镜 图像 模 糊 的缺点 ｌ。 ３ Ｊ
￥ 收 稿 日期 ：２ ０ ０ ９一Ｏ ５—３ （ Ｊ
的光 学显微 镜 ，是 形 态 学、分 子 生物 学、神 经科 学 、药理 学、遗 传 学等 领 域 中 新 一代 强有 力 的研 究 工具 。 目前 在神 经科 学研 究领 域 中的神 经 细胞 内物 质 的测 定 、神 经 细胞 外的研 究和 中枢神 经疾 病 的诊 断等得 到较 广 泛应 用 。
中山 大 学 研 究生 学 刊 （ 白然 科 学 、医 学 版 ）
二 ０— ０年 第 二期
２ 应 用
２ １ 神经细胞 内物质 的测定 ．
ＣＳ Ｌ Ｍ可 自动测定 细胞 物理 化学参 数 ，包括 细胞 形 状 、周 长 、面 积 、平均 荧光 强 度
及细胞 内颗粒 数等 参数 。能对 细胞 中离子 、蛋 白质 、酶 和受 体分 子 、Ｄ Ａ、Ｒ Ａ、线 粒 Ｎ Ｎ
得到 细胞 或组 织 内部 微细 结构 的荧 光 图像 ，使现 代显 微镜 有 能力研 究 和分 析 细胞 的变化 过程 和结 构 引。 目前 已在形 态 学 、分 子生 物 学 、神 经 科学 、药 理 学 、遗 传 学 等领 域 中 得到较 多应 用 。现 主要 介 绍 Ｃ Ｓ 的原 理及 在神 经科 学研 究 中 的应 用 。 ＬＭ
体 、溶 酶体 、内质 网、细胞 骨架 等 细 胞 内特 异结 构 的含 量 、组 分 及 分 布进 行 定 量 、定
性 、定 时及 定位 测定 ，使 细胞结 构和功 能方 面的研 究达 到分子 水平
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·５３０··实验研究·激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用武美娜李新毅白玮郭芬祁金顺【摘要】目的探讨激光共聚焦扫描显微镜（ＬＣＳＭ）技术在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中的应用。
方法采用原代培养大鼠皮层神经元，用ＬＣＳＭ测定给ＫＣＩ前后细胞内钙离子浓度的动态变化。
结果培养神经元状态良好。
用ＬＣＳＭ准确、稳定、可靠地测出细胞内钙离子浓度的动态变化。
结论ＬＣＳＭ在动态测定神经元细胞内钙离子浓度中具有明显优势。
【关键词】显微镜检查，共焦；细胞内钙离子浓度；皮层神经元ＵｓｅｏｆＩａｓｅｒｅｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｒａｔｃｏｒ－ｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓＷＵＭｅｉ－ｎａ＇，ＬＩＸｉｎ一蚋，ＢＡｌＷｅｉ，ＧＵＯＦｅｎ，ＱＩＪｉｎ－ｓｈｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔ）＇，Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１．Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｏｃｕｍｅｎｔｔｈｅｐｒｏｍｉｓｅｓｏｆｌａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＣＳＭ）ｉｎｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌａｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（『Ｃａ邳）ｊｎｓｕｂｊｅｅｔｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＭｅｔｈｏｄｓＬＣＳＭｗａｓｕｓｅ（１ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆｆＣａ２ｑｉｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒＫＣＩｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｕｓ．Ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｄｙｎａｍｉｃ『Ｃａ２＋］ｉｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＩ￡ＳＭ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＬＣＳＭｔｅｃｈｎｉｑｕｅｍａｙｓｈｏｗｐｒｏｍｉｓｅｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｉｎｆＣａ２＋］ｉ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＣＯｌｌｆｏｃａｌ；ＩｎｔｒａｃｅＵｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ＣｏｒｔｉｅａｌＣａ２＋是细胞内最为重要的阳离子和第二信使之一。
它对于神经递质释放、神经元之间信息传递和神经元存活等都具有重要意义。
神经元细胞内游离Ｃａｚ＋浓度（［Ｃａ：＋３ｉ）异常升高是导致胞内钙稳态失调和细胞死亡的重要因素…，因而观察神经元［Ｃａ２＋］ｉ的变化是神经生理学研究中的一个重要内容。
然而。
目前采用的一些测定细胞内钙离子浓度的方法．如Ｃａ“活化的发光蛋白法、偶氮染料法、ｃａ：＋选择性微电极测定法、发射示踪法、核磁共振法、荧光标记法等各有优势，但同时也有不足之处【引。
激光共聚焦扫描显微镜（１ａｓｅｒｃｏｎｆｏｃａｌｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＬＣＳＭ）是２０世纪８０年代诞生的一种先进的细胞生物学分析仪器。
利用紫外光或可见光激基金项目：国家自然科学基金科学部主任基金资助项目（３０７４００９５）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（２００６０１１４００４）；山西省自然科学基金资助项目（２００６０１１０５）；山西省重点实验室开放基金资助项目（２００６０３０１２）作者单位：０３０００１太原，山西医科大学生理教研室（武美娜、郭芬、祁金顺）；山西医科大学第一医院神经内科（李新毅）；山西省肿瘤医院病理科（白玮）通讯作者：祁金顺发荧光探针，计算机进行图像处理。
可以对活细胞生理信号、离子含量如Ｃａ嗽度进行实时动态分析检测。
ＬＣＳＭ具有高灵敏度、高分辨率、高放大倍数的特点。
可进行定性、定量、定时、定位的分析测量，是近代生物医学技术最重要的发展之一。
因此，它已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域新一代强有力的研究工具［，，４｜。
ＬＣＳＭ的一个显著优点是可以对同一样品平面随时间进行连续扫描。
进而分析细胞结构或细胞内离子含量的动态变化。
对细胞内Ｃ矿的动态测定，要求仪器具有实时、连续测定的能力。
本文介绍使用ＬＣＳＭ在原代培养大鼠皮层神经元细胞内Ｃａ２＋浓度动态测定中的具体应用及其优势。
１材料和方法１．１大鼠皮层神经元的原代培养：取新生１～３ｄＷｉｓｔａｒ大鼠，无菌条件下分离大脑皮层，剪碎（＜ｌｉｎｌｎ，）。
以终浓度为０．０３２５％的胰蛋白酶消化（３７℃，５—１０ｍｉｎ），用含胎牛血清的培养基终止消化，火抛光的Ｐａｓｔｅｕｒ吸管轻轻吹打１０～２０次，静置沉淀３～５ｍｉｎ．取上液２００目筛网过滤后１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ．弃上清。
加含１５％胎牛血清的达氏修正依氏培养基（ＤＭＥＭ）完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞密度为ｌｘｌ０６／ｍ１．种植于预先用多聚赖氨酸液包被的３５ｍｍ培养皿中，在３７℃、饱和湿度并通有５％ＣＯ：的孵箱中培养。
２４ｈ后换液移除碎片，４８ｈ后加入１０Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ的阿糖胞苷以抑制非神经元细胞的增殖。
以后每周２次进行半量换液。
１．２荧光标记：实验当天，取镜下状态良好的细胞．以生理盐溶液（ＮａＣＩ１３０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣＩ５．４ｍｍｏｌ／Ｌ。
ＣａＣｌ２１．８ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２ｌｍｒｎｏｌ／Ｌ，葡萄糖２５ｍｍｏｌ／Ｌ，４羟基乙基哌嗪乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ，用ＮａＯＨ调ｐＨ值为７．４）冲洗３次，换掉培养基，以荧光染料负载。
目前最常用的荧光染料为ｆｌｕｏ一３，其激发波长和发射波长分别为４８８ｎｍ和５２６ｎｍ。
该染料具有荧光选择性强、自身无荧光，只有进入细胞内与游离钙结合后才发出荧光。
不需紫外光激发等特点，因而能有效避免非特异性染色，避免紫外光对活细胞样品的损伤，具有细胞损伤小、敏感性高、不易淬灭、测量不易受干扰等优点。
通常ｆｌｕｏ一３的母液浓度为ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌ，以二甲基哑砜（ＤＭＳＯ）溶解。
一２０℃保存。
实验当天以生理盐溶液稀释至终浓度为１—５斗ｍｏｌ／Ｌ，负载条件为２０—３７℃、１５～６０ｍｉｎ。
在本实验条件下使用４Ｉｘｍｏｌ／Ｌｆｌｕｏ一３３７℃下负载５０ｍｉｎ。
为促进ｆｌｕｏ一３溶解和细胞内负载，可同时加入２０％的ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ一１２７促进ｆｌｕｏ一３进入细胞。
ｌ－３神经元［Ｃａ２＋］ｉ测定：负载结束后，用生理盐溶液洗去细胞外多余染液，根据实验要求不同，加入一定量的生理盐溶液。
将培养皿置于共聚焦显微镜（ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ５）载物台上，选择镜下细胞分布均匀、染色良好的视野。
本实验使用ｆｌｕｏ一３染色，其激发波长和发射波长分别为４８８ｎｍ和５２６ｎｍ。
设定基础荧光强度值，观察基线一段时间后，加入药物，共观察２４０Ｓ，获得连续［Ｃａ２＋］ｉ的动态变化。
１．４后期分析处理：实验结束后，使用Ｌｅｉｃａ自带分析软件进行分析处理。
此时可手工选定细胞．并可同时对多个细胞进行分析处理。
实验结果可以实时获得，包括每个时间点的静态图片、整个实验中细胞内荧光强度的连续动态记录（动画显示和动态时间曲线），还可以在处理后方便地得到每一时间点的灰度值并转为Ｅｘｃｅｌ数据。
进行后期处理。
可对实验结果进行定性或定量分析。
定性分析根据Ｌｅｉｃａ自带分析处理软件给出的动态曲线可以直接观察给药前后［ｃａｚ＋］ｉ的变化。
·５３１·而定量分析则需对每一时间点的灰度值进行统计学的分析处理，可以直接使用仪器所测荧光强度或用给药前后荧光强度的比值，即相对荧光强度，观察给药前后［Ｃａｚ＋］ｉ的变化及给予不同药物后［Ｃａ２＋］ｉ的差别。
１．５统计学处理：每组实验重复３次，每次设平行皿２个。
所有结果以互蜘表示，组间差异采用ｔ检验．以Ｐ＜０．０５差异有统计学意义。
２结果２．１用于Ｃａ２＋成像实验的原代培养细胞：根据实验目的不同，可选择不同培养天数的细胞进行实验。
在相差倒置显微镜下观察．神经元在接种后６ｈ大部分已贴壁．并开始有短的突起长出：２４ｈ后突起延伸变长，胞体完整，表面光洁，边缘清晰，立体感明显，折光性强，四周光晕良好：３～５ｄ后神经元突起间已形成突触联系和神经元网络。
随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐变大。
网络更加发达：ｌ周后可看到明显的细胞核及核仁。
在该培养条件下。
神经元可存活半个月以上．仍保持较好形态。
本实验选用培养６～８ｄ的细胞．在进行荧光负载前，先在明场下选择细胞膜界限清晰、胞体光亮、形态良好，同时可清楚分辨胞体的细胞，见图ｌ。
２．２荧光负载后细胞：以荧光染料ｆｌｕｏ一３进行负载后．在荧光显微镜下可以看到负载后的细胞胞体发出绿色荧光。
由于显微镜可测灰度值变化范围在０～２５５．若超出此范围则不能正常工作，所以此时要调整荧光强度。
以能够明确分辨细胞为准。
本实验所用细胞荧光负载后见图２。
２．３９０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ引起的细胞内Ｃａ“反应：在本实验中。
给予９０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＫＣＩ，以确定细胞的状态。
可以看到给ＫＣＩ后，［Ｃａｚ＋］ｉ快速明显升高，增幅超过１００％，证明细胞保持良好状态。
给予ＫＣＩ后，［Ｃａ“］ｉ的静态图片和动态变化曲线分别见图３，４。
３讨论３．１细胞培养介质的选择：对于培养细胞的介质，可以有多种选择。
例如使用不同大小的盖玻片或直接将细胞培养于单个的３５ｍｍ培养皿、６孔板、２４孑Ｌ板、９６孔板均可。
目前，随着ＬＣＳＭ的发展，已有其专用的培养皿．但只能一次性使用，且成本较高。
此外，也可自制专用于测钙的小皿，选择合适大小的培养皿．在其底部中心．根据培养细胞所用盖玻片的大小，可以自制一相应大小的圆孔，底部外侧贴较大盖玻片。
内侧孔内置入带有培养细胞的盖玻片，可重激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用（正文见第５３０页）图１培养大鼠皮层神经元形态结构ＬＣＳＭｘ６００图２荧光负载后细胞形态结构及荧光强度ＬＣＳＭｘ６００图３给予９０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ后细胞荧光强度明显升高ＬＣＳＭ×６００图４给予ＫＣｌ后［ｃａｚ＋］ｉ的动态变化曲线氯沙坦对大鼠肾脏缺血再灌注足细胞损伤保护作用的实验研究（正文见第５３６页）图１各组大鼠肾组织足细胞电镜改变（ａ：假手术组；ｂ：缺血组；ｃ：缺血再灌注组；ｄ：氯沙坦治疗组）ｘ８０００图２免疫荧光检测各组大鼠肾组织中ｎｅＤ¨ｎ变化（ａ：假手术组；ｂ：缺血组；ｃ：缺血再灌注组；ｄ：氯沙坦治疗组）ｘ２００激光共聚焦扫描显微镜技术在大鼠皮层神经元细胞内钙离子浓度动态测定中的应用作者：武美娜， 李新毅， 白玮， 郭芬， 祁金顺， WU Mei-na， LI Xin-yi， BAI Wei， GUO Fen， QI Jin-shun作者单位：武美娜,郭芬,祁金顺,WU Mei-na,GUO Fen,QI Jin-shun(山西医科大学生理教研室,太原,030001)， 李新毅,LI Xin-yi(山西医科大学第一医院神经内科)， 白玮,BAI Wei(山西省肿瘤医院病理科)刊名：中国药物与临床英文刊名：CHINESE REMEDIES & CLINICS年，卷(期)：2008,8(7)被引用次数：4次1.Hidalgo C;Nú(n)ez MT Calcium,iron and neuronal function[外文期刊] 2007(4-5)2.赵彩霞;郑延松;田敏细胞内游离钙检测方法进展[期刊论文]-国外医学(临床生物化学与检验学分册) 2001(02)3.Chen JT;Chen RM;Lin YL Confocal laser scanning microscopy:an overview of principle and practice in biomedical research 2004(01)4.Amos WB;White JG How the confocal laser scanning microscope entered biological research 2003(06)1.高秀萍.祁金顺.乔健天.GAO Xiu-ping.QI Jin-shun.QIAO Jian-tianβ-淀粉样蛋白25-35片段抑制大鼠皮层神经元大电导钙激活钾通道[期刊论文]-中华神经医学杂志2006,5(5)2.武美娜.祁金顺.乔健天.WU Mei-Na.QI Jin-Shun.QIAO Jian-Tianβ-淀粉样蛋白抑制海马长时程增强机制的研究进展[期刊论文]-生理科学进展2006,37(3)3.祁文秀.张宇.祁金顺.乔健天.Qi Wenxiu.Zhang Yu.Qi Jinshun.Qiao Jiantian大鼠鞘内注入前强啡肽原的反义寡聚核苷酸减弱福尔马林引起的脊髓背角中强啡肽A的合成和行为痛反应:细胞免疫化学和行为学联合观察[期刊论文]-神经解剖学杂志2003,19(4)4.张俊芳.侯磊.郭芬.祁金顺.ZHANG Jun-fang.HOU Lei.GUO Fen.QI Jin-shun大鼠在体海马CA1区长持续长时程增强的记录[期刊论文]-山西医科大学学报2009,40(1)5.乔健天.韩中胜.祁金顺.QIAO Jian-Tian.HAN Zhong-Sheng(Victor).QI Jin-Shun中枢神经元树突电活动和树突返传动作电位在突触可塑性调控中的作用——悼念树突功能研究的先驱张香桐院士[期刊论文]-生理学报2008,60(2)6.林元相.徐如祥.姜晓丹.康德智.柯以铨.杜谋选.蔡颖谦.Lin Yuan-xiang.Xu Ru-xiang.Jiang Xiao-dan.Kang De-zhi.Ke Yi-quan.Du Mou-xuan.Cai Ying-qian激光共聚焦扫描显微镜动态观察体外培养大鼠皮层神经元受氯化亚铁作用时过氧化物水平及膜电位的变化[期刊论文]-中国临床康复2006,10(17)7.郭芬.武美娜.景玮.祁金顺.GUO Fen.WU Mei-na.JING Wei.QI Jin-shun双电极绑定技术记录在体大鼠海马CA1区长时程增强[期刊论文]-中国应用生理学杂志2007,23(3)8.周永军.牛中奇.侯建强.陈建华.白冰.黄华.ZHOU Yong-Jun.NIU Zhong-Qi.HOU Jian-Qiang.CHAN Jian-Hua. BAI Bing.HUANG Hua细胞内自由钙离子浓度变化的时-频分析[期刊论文]-中国生物医学工程学报2009,28(6)9.殷文娟.李新毅.祁金顺CaMKⅡ磷酸化介导海马长时程增强的诱导及淀粉样β蛋白引起的长时程增强伤害[期刊论文]-中西医结合心脑血管病杂志2008,6(5)10.殷文娟.祁金顺海马LTP/LTD诱导中CaMKⅡ磷酸化水平的变化[期刊论文]-山西医药杂志2009,38(4)1.郝莹莹.施志仪.李文娟.靳雨丽维生素D3对三角帆蚌外套膜细胞内 Ca2+浓度的影响[期刊论文]-动物学杂志2011(3)2.吴海涛.江涌.张晓冬.夏海坚.唐兆华.孙晓川载脂蛋白E基因多态性对星形胶质细胞损伤早期胞内Ca2+浓度的影响[期刊论文]-中华创伤杂志 2010(8)3.周丽娜.叶文博野木瓜注射液及其提取物对脊髓神经元的氧化保护和生长促进作用[期刊论文]-上海师范大学学报（自然科学版） 2011(5)4.芦鑫.程永强.李里特研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展[期刊论文]-中国粮油学报 2010(1)本文链接：/Periodical_zgywylc200807007.aspx。