实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定
实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定
一、实验目的和要求
1）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。
2）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。
3）了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。
4）掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。
5）学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。
二、器材和试剂
1．实验器材：
层析系统LH-2，（包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器）6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml，各16个；移液管1、2、5ml, 各16个；量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器 4个；滴管， 16个；滤纸φ120， 1盒；
2．实验试剂：
(1)丙酮；(2)1％，pHl.15的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2／3总体积的蒸馏水溶解，用6mol／L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol／L,pH6.5，磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol／L 氯化钠—0.5mol／L氢氧化钠溶液；(5)0．5mol／L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠—0.02mol ／L磷酸盐缓冲液，pH6.5；(7)底物缓冲液：0.05mol／L，Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含2.22mol／L的氯化钙；(8)2mmol／1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg／mL胰蛋白酶溶液：用0.001 mol／L盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）鸡蛋 30个；（13）1％硝酸银
三、实验原理
1．蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。2．鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性质:
鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。
鸡卵类黏蛋白至今还未能获得单一组分的制品，目前至少已获得4种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上差别不大，但是在糖基部分(主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸)的含量有差别。由于Ovomucoid所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，其pI大致在3.9-4.5，相对分子质量28 000，卵类黏蛋白抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：1。
卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。Ovomucoid带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。Ovomucoid 在280nm处的百分消光系数A1%1cm.280 = 4.13，即蛋白酶浓度为1mg/ml时,溶液的吸光度A280 = 0.413 ，据此可以测定其溶液中蛋白质的含量。
本实验主要参照Kassell的方法，鸡蛋清经三氯乙酸(TCA)—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗晶，再用DEAE-纤维素柱层析纯化而得合格产品。
四、实验步骤
1．鸡卵类黏蛋的提取
取50mL鸡卵清，加入等体积的10％，pH1.15三氯乙酸溶液(缓缓加入以防局部过酸出现块状物)，形成类似于酸奶状的白色沉淀，轻轻地搅拌均匀。在酸度计上检查最终pH值应为大约3.5，若pH值偏离3.5±0．2则要用5mol／L氢氢化钠或5mol/L盐酸调节pH值，由于提取液非常稠，在调节pH值时防止局部过酸或过碱。pH值调好稳定后，在室温下静置4h以上。待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r／min离心10min。弃去沉淀物，上清液用滤纸过滤，以除去上清液中脂类物质及其他不溶物。收集滤液转入500mL的烧杯内。检查滤液的pH值是否为3.5，否则要调回到pH3.5。置冰浴或冰箱内冷却片刻，缓慢加入3倍体积预冷的丙酮，用玻璃棒轻轻搅匀，用塑料薄膜盖好封严，在冰浴里放置2～4h，待鸡卵类黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部转移到50mL带盖的离心杯里，加盖经平衡后以3000r／min离心15min，除去上清，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去残留丙酮。使沉淀物由白转变为透明黏稠物后停止抽气。加入20mL蒸馏水溶解，若溶解液混浊则用滤纸滤去不溶物。滤液经SephadexG-25柱层析法脱盐或者经透析除盐。
2．鸡卵类黏蛋的脱盐
用SephadexG-25柱层析法脱盐的操作如下：
称取30gSephadexG-25，用500mL0.02mol／L，pH6.5的磷酸盐缓冲液在100℃热溶胀
2h或者室温下溶胀24h。脱气后装柱(35mmx300mm)，柱床体积约150mL。用约2倍体积的0.02mol／L，pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，其A280小于0.02即可上样。
取20mL鸡卵类黏蛋白提取液上柱(上样量不超过柱床体积的1／6)。用同样的缓冲液洗脱，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后盐才开始流出，盐通常在280nm无明显光吸收，若绘出第二峰则是残留丙酮峰。丙酮和盐同时流出。洗脱曲线见下图。
3．鸡卵类黏蛋白的纯化
1 2
通过上述方法获得的鸡卵类黏蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等电点不同，采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。
称取10g DEAE-纤维素粉(DE-32)，用150mL 0.5 mol／L氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶液浸泡20min。用布氏漏斗(内垫为200目尼龙网)抽滤。用蒸馏水洗至pH8．0左右，抽干。然后移至500mL的烧杯内，用150mL0.5mol／L盐酸溶液浸泡20min，再转移到布氏漏斗内，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用150mL0.2mol／L，pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡约15min，经真空干燥器脱气后装柱。
取一支层析柱(35mmx200mm)装入约1／4体积的0.02mol／L，pH6.5磷酸盐缓冲液，将处理过的DEAE-纤维素装入柱内。以同一缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，待A280值小于0.02即可加样。
将经SephadexG-25脱盐后的鸡卵类黏蛋白溶液上柱吸附。以0.02mol／L,，pH6．5的
磷酸盐缓冲液平衡，基线稳定后，改用0.3mol／L氯化钠 0.2mol／L，pH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集第二洗脱峰。柱层析图谱见上图。在鸡卵类黏蛋白液中所含的鸡卵清清蛋白，在洗脱时可能出现一个小峰或不明显的峰形。在这种情况下可根据峰形大小，测定活性来确定鸡卵类黏蛋白洗脱峰的位置。
4.鸡卵类黏蛋白纯品的制备
经DEAE-纤维素离子交换柱层析制得的鸡卵类黏蛋白溶液装入透析袋内，用蒸馏水进行透析，间隔一段时间更换一次蒸馏水，直至经1％硝酸银检查无氯离子为止。将透析过的鸡卵类黏蛋白溶液转移到烧杯内，小心地用1mol／L盐酸调节至pH4.0，取出lmL，稀释5～10倍测定鸡卵类黏蛋白的含量及活性。然后加入3倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封严烧杯口，在冰浴里静置4h左右。待鸡卵类黏蛋白完全析出后，倾去上清，沉淀转移到一个带盖的50mL离心杯内，于3000r／min离心15min，弃上清，沉淀物放人真空干燥器内干燥，即可得到透明胶状物---鸡卵类黏蛋白(约200—300mg)。
5．鸡卵类黏蛋白的含量测定
配成一定浓度的鸡卵类黏蛋白溶液，测定A280。鸡卵类黏蛋白的消光系数是：A1%1cm=4.13。
鸡卵类黏蛋白(mg／mL)=(A280╳稀释倍数)/0.413
6.鸡卵类黏蛋白的活性测定 (选做)
鸡卵类黏蛋白的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力单位表示。即：抑制1个胰蛋白酶活力单位(BAEE单位)所需卵类黏蛋白量定为抑制剂的1个活力单位。
取2个石英比色池(带盖，光程为l cm)，一个加入0.05mol／L，pH8．0 Tris-HCl缓冲液和2．0mol／L，BAEE底物溶液各1.5mL混匀，在波长253nm处调整仪器零点。另一个比色池内加0.05mol／L，pH8.0，Tris-HCl缓冲液1.5mL，10μL胰蛋白酶液(约10μg胰蛋白酶)，10μL鸡卵类黏蛋白(约5-10μg鸡卵类黏蛋白)轻轻摇匀，在室温下(最好是在25℃恒温箱内)放置2min．
如蛋白酶与鸡卵类黏蛋白充分结合。然后加入2mol／L BAEE底物溶液1．5mL，立即混匀并记时。于波长253mn处测定其光吸收递增值ΔA253／min。每隔30 s读数一次，使ΔA253／min值控制在0.05左右为宜，否则要根据ΔA253／min的大小适当减少或增加鸡卵类黏蛋白的量。
以反应时间t为横坐标，A253为纵坐标作图，取直线部分的任一时间间隔与相应的光吸收变化值为ΔA253／min用A2表示。与此同时，以同样的方法(不加鸡卵类黏蛋白：测胰蛋白酶的活性。通过作图得到光吸收变化值ΔA253／min，用A1表示。
鸡卵类黏蛋白的抑制活性及抑制比活性的计算公式如下：
鸡卵类黏蛋白的抑制活性单位(BAEE)=(A l-A2)/0.001
鸡卵类黏蛋白抑制比活单位(BAEE单位/mg胰蛋白酶)=(Al-A2) ╳1000/（Al-A2）/I╳0.001 式中 A l：胰蛋白酶ΔA253／min；A2：加入抑制剂后胰蛋白酶ΔA253／min；I：
测定时所用鸡卵类黏蛋白的量(μg)；1000：将抑制剂的微克数转换成毫、克数；
0.001：指吸光度每增加0.001定义为1个BAEE单位。
五、注意事项
1．加入丙酮沉淀在冰浴中保持4小时，注意保持冰浴状态。
2．层析柱下端过滤网孔径应与凝胶溶胀直径相匹配，防止漏胶或上下端压力差过大造成上端出水。
六、思考题
1. 纯化蛋白质时如何选择离子交换树脂？
2. 如何选择离子交换条件？
3. 离子交换剂如何进行再生？
4. 如何对基线进行调零？
蛋白质分离纯化的步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
DNA与蛋白质分离与鉴定巩固习题
DNA与蛋白质分离鉴定巩固练习 姓名：_______________ 学号：________ 成绩：________________ 一、选择题。 1.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是 ( ) A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl浓度的升高而增大 B.DNA对洗涤剂的耐受性差，对高温的耐受性强 C.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色 D.可以选择新鲜的猪血、花椰菜等作为实验材料 2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些物质溶于酒精溶液。下图为“DNA的粗提取”实验的相关操作步骤，其操作目的错误的是（） A.①是洗涤红细胞、去除红细胞表面的杂质 B.②是稀释NaCl溶液至0.14mol/L，析出DNA C.③是选用2mol/LNaCl溶液，溶解粘稠物中的DNA D.④是纯化DNA，去除溶于95%酒精的杂质 3.在利用洋葱进行DNA粗提取的实验中，加入洗涤剂和食盐的作用分别是 ( ) A.破坏细胞壁；溶解DNA B.破坏细胞膜；溶解DNA C.破坏细胞壁；溶解蛋白质 D.破坏细胞膜；溶解蛋白质 4.下列关于DNA粗提取与鉴定的说法正确的是 ( ) A.析出DNA时要缓慢地加蒸馏水，当析出黏稠物时即不再加水 B.在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐 C.提取的DNA溶解后加入二苯胺试剂即可染成蓝色 D.将含有DNA的滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白质杂质 5.去除DNA杂质时，可直接在滤液中加入（），反应10－15min A.嫩肉粉 B.蒸馏水 C.2mol/lNaCl D.酒精 6.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（） A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出 7.下列操作中，对DNA的提取量影响较小的是（） A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，发出DNA等核物质 B.搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动 C.在析出DNA粘稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多 D.在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 8.在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（） A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞表面的蛋白质 D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯 9.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验原理与方法的叙述，错误的是 ( ) A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随着溶液浓度的减小而减小 B.向鸡血细胞中加入蒸馏水的目的是使其吸水涨破，释放出其中的DNA C.向滤液中加入冷却的酒精的目的是除去DNA中的杂质，纯化DNA D.向初步纯化的DNA中加入二苯胺溶液，沸水浴后可观察到溶液显蓝色 10.与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 ( ) A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出
盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白的初步研究
盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白 2 摘要：鸡蛋清原液用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液稀释5倍，4℃下静置至少6 h，采用30%～80%不同饱和度的硫酸铵分离卵白蛋白，采用Bradford法测定盐析后蛋白含量，SDS-PAGE检测其纯度，结果表明，60%饱和度的硫酸铵分离鸡蛋清卵白蛋白效果较好。 关键词：盐析法；鸡蛋清；卵白蛋白 鸡蛋中含有丰富的生命必需元素，营养价值较高。随着对鸡蛋生理生化活性研究的不断深入，对鸡蛋的利用逐渐超越简单的初加工阶段，趋向于开发具有较高附加值的生理活性物质[1-2]。蛋清是一种以水为分散介质，以蛋白质为分散相的典型胶体物质，鸡蛋清中的蛋白质含量约为总量的11%，除不溶性的卵黏蛋白外，均为可溶性蛋白质。卵白蛋白、卵铁传递蛋白和溶菌酶是其中3种主要的生物活性蛋白质。 卵白蛋白是蛋清中主要的活性蛋白，约占蛋清蛋白质含量的54%。卵白蛋白具有许多功能特性[3]，例如，卵白蛋白对胰蛋白酶有强烈抑制作用，能部分抑制枯草杆菌蛋白酶活性[4]；Fujita用胃蛋白酶水解卵白蛋白，并用RP-HPLC分离出具有血管舒张活性的物质OA358-365[5]；Davalos和Xu等研究发现，卵白蛋白酶降解物具有强抗氧化活性的多肽[6-7]。卵白蛋白是生物化学中一种重要的参考蛋白质，包含所有的必需氨基酸，而且比例合理。高度纯化和结晶的卵白蛋白可以作为载体、稳定剂、封阻剂或标准物等，也可作为营养添加剂应用于食品工业。虽然许多学者对卵白蛋白进行了大量研究，但对其生物学特性和功能的了解仍不够全面，本文采用硫酸铵盐析的方法，对鸡蛋清中的卵白蛋白进行了快速初步分离，为其进一步开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 新鲜鸡蛋，购自超市；卵白蛋白标准品，Sigma公司；硫酸铵分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；透析袋，Amersham Bioscicnccs(SF)Corp。 1.2 试验方法 1.2.1 鸡蛋清原液的制备 取新鲜鸡蛋，用双层灭菌纱布过滤得到水样成分，充分搅拌30 min（搅拌剧烈程度以不起泡沫为准）。为了降低鸡蛋清粘度以利于后续试验，取5 mL鸡蛋清用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液（50 mL 0.1M Tris-base 溶液与5.7 mL 0.1M HCl溶液混匀后，冷却到室温，加水定容到100 mL）进行5倍稀释，4℃下静置至少6 h。 1.2.2 鸡蛋清卵白蛋白盐析法分离 将静置蛋清4℃、10000 rpm离心10 min，取上清液，缓慢多次加入烘干研磨成粉末的硫酸铵，磁力搅拌，使加入粉末溶解，并参考硫酸铵溶液饱和度计算表，使其饱和度分别达到30%、40%、50%、60%、70%和80%。4℃静置过夜，于4℃、12000rpm离心10 min，不同饱和度离心所得沉淀均用pH 9.0的Tris-HCl 缓冲液溶解，并在4℃、0.05 M的Tris-HCl缓冲液中进行透析。期间更换透析液2~4次，透析过夜。 1.2.3 蛋白质检测 蛋清盐析蛋白质含量采用Bradford法测定[8-9]：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色，蛋白与考马斯亮蓝反应后，溶液在分光光度计波长595 nm处吸光度与蛋白质含量成正比。用BSA蛋白标准液在波长595 nm处测得的吸光值绘制标准曲线（见表1），不同饱和度盐析得到的蛋白样品在595 nm波长测得的吸光值，通过标准曲线得到蛋白含量。采用SDS-PAGE检测盐析后卵白蛋白的纯度。 表1 标准曲线配比表 处理序号0.01%BSA标准液 （μL） 蒸馏水（μL） 考马斯亮蓝 （μL） 蛋白质含量 （μg/mL） 1 0 200 1000 0 2 40 160 1000 20 3 80 120 1000 40 4 120 80 1000 60 5 160 40 1000 80
蛋白质的分离纯化和表征
蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量
基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
人卵清蛋白特异性IgE(OVA sIgE)酶联免疫分析试剂盒使用说明
人卵清蛋白特异性IgE（OVA sIgE）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 特异性：本试剂盒可同时检测人OVA sIgE，且与其他抗体无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中OVA sIgE含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 实验原理 用OVA包被酶标板，制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人IgE抗体进行反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的OVA sIgE呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品中OVA sIgE的效价（抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价）。试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。 2.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。 3.辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgE抗体稀释液（HRP-anti-guinea IgE Diluent）：1×10ml/瓶。 4.辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgE抗体（HRP-anti-guinea IgE）：1×120μl/瓶（1：100）。 5.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 6.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 7.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
兔(Rabbit)卵清蛋白特异性IgG(OVA-sIgG)-NEWA
上海笃玛生物科技有限公司 本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断 兔（Rabbit）卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG） ELISA 检测试剂盒 使用说明书 检测原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被抗卵清蛋白特异性IgG（OVA-sIgG）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的卵清蛋白特异性IgG （OVA-sIgG）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细 胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟 取上清。5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存 于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱操作注意事项1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的 浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保 存。3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(二)
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二） 一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。 该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相
蛋白质分离与纯化教学设计课题
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
分离纯化蛋白质的方法及原理
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定
实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定 一、实验目的和要求 1）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。 2）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。 3）了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。 4）掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。 5）学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。 二、器材和试剂 1．实验器材： 层析系统LH-2，（包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器）6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml，各16个；移液管1、2、5ml, 各16个；量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器 4个；滴管， 16个；滤纸φ120， 1盒； 2．实验试剂： (1)丙酮；(2)1％，pHl.15的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2／3总体积的蒸馏水溶解，用6mol／L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol／L,pH6.5，磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol／L 氯化钠—0.5mol／L氢氧化钠溶液；(5)0．5mol／L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠—0.02mol ／L磷酸盐缓冲液，pH6.5；(7)底物缓冲液：0.05mol／L，Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含2.22mol／L的氯化钙；(8)2mmol／1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg／mL胰蛋白酶溶液：用0.001 mol／L盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）鸡蛋 30个；（13）1％硝酸银 三、实验原理 1．蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。2．鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性质: 鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。
蛋白表达、分离和纯化
蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材
一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
实验六 鸡蛋清中清蛋白的提取与定量测定
实验八：鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定 分16组，每组两人 一、目的 掌握盐析沉淀法提取鸡蛋卵清蛋白的提取和定量测定（考马斯亮蓝G-250） 二、原理 沉淀法也称溶解度法。其纯化生物大分子物质的基本原理是，根据各种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质,(如PH，极性离子强度，金属离子等)，就能使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。换句话说就是，不同物质置入相同的溶液，溶解度是不同的；相同的物质置入不同的溶液，溶解度也是不一样的。因此选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最小溶解度，而使杂质呈现最小的溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大的溶解度，然后经过适当的处理，即可达到从抽提液中分离有效成分的目的。 盐析法是根据蛋白质再稀盐溶液中，溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出（盐析），盐析导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液析出。三、实验材料 鸡蛋
四、实验步骤 1.将鸡蛋一端敲一小孔，用吸管吸取卵清蛋白 2.5毫升，加生理盐水 2.5毫升得到稀释液 2.逐滴加入饱和硫酸铵溶液5毫升（边加边搅拌）静置10分钟，3000转每分钟离心10分，弃沉淀，取上清液。 3.再在上清液中加固体硫酸铵，至不能在溶解硫酸铵为止，静置10分钟 4. 置于离心管中以3000转每分钟离心十分钟，弃上清液，沉淀用5毫升生理盐水溶解（粗产品） 5. 取1毫升粗产品进行稀释，使其吸光值在0.1-1之间。 6. 用1毫克每毫升的标准牛血清蛋白溶液制作标准曲线及测定上述稀释后产品的蛋白含量 7.记录结果，数据处理。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最