实验五 鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定
鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定
鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定摘要：鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid，简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用。
采用有机溶剂沉淀法将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）—丙酮溶液处理，除去沉淀物，经丙酮分级沉淀活的粗品，再经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品，然后用Folin-酚法测定卵类粘蛋白的抑制活力测得纯蛋白的抑制活力大于粗蛋白的抑制活力，最后通过SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳测定蛋白质分子量测得粗蛋白的相对分子量为34311纯蛋白的相对分子量为32924与理论值有一定差距。
关键词：鸡卵类粘蛋白; 胰蛋白酶; 有机溶剂 ;层析; 电泳中图分类号：Q文献标识码：AIsolation and purification of CHOM and its activity 、 molecular weight determinationAbstract:Chicken ovomucoid (CHOM) is a glycoprotein made from chicken egg white, it has a strong role in inhibiting trypsin. Organic solvent precipitation method using egg white by trichloroacetic acid (TCA) - acetone solution was to remove sediment by acetone precipitation of live crude, through the DEAE cellulose (diethylaminoethyl cellulose) column layer Analysis of purified products derived from qualified, then Folin-phenol method ovomucoid inhibited activity, and finally by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis determination of protein molecular weight of coke.Key words:CHOM ;Trypsin ; organic solvent ; chromatogram ; electrophoresis.鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid 简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用[1]，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。
实验一 鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化
实验一鸡蛋清中卵白蛋白和卵球蛋白分离与纯化一、实验目的了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作.了解葡聚糖凝胶SephadexG-25分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术.二、实验原理据研究结果分析每百克鸡蛋含蛋白质12.8克，主要为卵白蛋白和卵球蛋白，还含有少量的卵粘蛋白、卵转铁蛋白、类卵粘蛋白、溶菌酶等，其中含有人体必需的8种氨基酸。
本次实验利用盐析法和柱层析法分离和纯化卵白蛋白和卵球蛋白。
盐析的原理：蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关。
分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。
改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。
脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。
G-25:1000---5000；G-50:1500---30000；G-75:3000---80000 三、实验用品仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置器皿：5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-25饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70-80℃水温中搅拌溶解。
将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
四、实验步骤1、卵清蛋白与卵球蛋白的分离取卵清2mL于试管中；加2mL的半饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，静置2分钟；3000r/min,离心5分钟；沉淀为卵球蛋白(M130000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。
取上清液，加入固体硫酸铵（计算4mL溶液饱和度由50%变化为100%需要加入硫酸铵的克数1.57g）；3000r/min，离心5分钟；沉淀为卵清白蛋白(M43000)，加蒸馏水定容至4mL溶液。
实验设计：卵清蛋白
实验注意事项
1 2 3
蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉，分离效果不好。 • 蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率较低。一 般蛋白质浓度在2.5%～3.0%较适中。
蛋白质提取过程中须注意温度的控制，一般在20℃ 以下进行
调节等电点一定要准确，在本实验中，球蛋白和卵 清蛋白的等电点相差较小，若不准确，会导致蛋白 质不纯。
9 提取液
1.0 3.0
0 4.0 0
0.5 3.5 0.125
1.0 3.0 0.25
1.5 2.5 0.375
2.0 2.0 0.50
2.5 1.5 0.625
3.0 1.0 0.75
4.0 0 1.0
实验步骤
（二）蛋白提取液中蛋白质含量测定 1、提取液分别稀释1倍、10倍、20倍后，取待测蛋白质 溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测 蛋白质的浓度。 排除干扰：将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm 和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的 吸收差求出蛋白质浓度。 2.计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260 （式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下 测得的光吸收值）
.
弃上清液
实验步骤
二.卵清蛋白活性测定：
（一）紫外吸收法测定卵清蛋白的含量 1、标准曲线法 （1）标准曲线的绘制 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。在280nm波长处分别测定各 管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
试管号 试剂 标准蛋白溶液 /mL 蒸馏水/mL 蛋白质浓度 /mg/mL A280 1 2 3 4 5 6 7 8
从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法
从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的方法
1卵类黏蛋白
卵类黏蛋白是一类可以在动物卵液中发现的蛋白质。
它们可以将鸡胚募集到一起，增强鸡蛋的结构稳定性，并提供保护。
一般而言，卵类黏蛋白的结构和特性决定着卵的物理机能性。
2从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白
从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的常见方法是复合膜离心法。
根据有机化合物数量不同，可采取不同的柱装置进行构建有机化合物，包括反相层析柱、正相层析柱、活性柱和离子交换柱。
事先采用离心法将鸡蛋清分离出来，得到洁净的蛋清液；然后使用复合膜离心法将卵类黏蛋白从洁净的蛋清中纯化出来。
3复合膜离心法的利用
复合膜离心法可将卵类黏蛋白从洁净的蛋清液中快速分离出来，具有较高的效率和稳定性。
它主要包括两个步骤：沉淀膜分离与浓缩离心分离。
首先，有机溶液中的粒子和蛋白质被沉淀膜分离出来；然后，经过浓缩离心分离，可快速净化出洁净的卵类黏蛋白。
此外，通过可调节的pH值，正确地控制溶液的离子强度，可有效提取卵类黏蛋白。
4结论
从鸡蛋清中提取卵类黏蛋白的最佳方法是采用复合膜离心法，该方法具有较高的效率和稳定性。
通过正确控制pH值和溶液离子强度，还可以有效地提取卵类黏蛋白。
因此，复合膜离心法应该成为从鸡蛋清中高效提取卵类黏蛋白的理想方法。
卵清蛋白质实验报告
一、实验目的1. 了解卵清蛋白质的组成、结构和功能性质。
2. 掌握卵清蛋白质的提取、分离和纯化方法。
3. 学习蛋白质功能性质的检测方法。
二、实验原理卵清蛋白质是鸡蛋中的一种重要蛋白质，占鸡蛋蛋白质总量的60%左右。
卵清蛋白质具有丰富的氨基酸组成，营养价值高，是食品、医药和生物工程等领域的重要原料。
本实验主要研究卵清蛋白质的提取、分离、纯化和功能性质。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、硫酸铵、氯化钠、NaOH、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯乙酸、硫酸铜、酚酞指示剂等。
2. 仪器：离心机、冰箱、电子天平、pH计、电泳仪、紫外分光光度计、离心管、烧杯、移液器等。
四、实验步骤1. 卵清蛋白质的提取（1）将新鲜鸡蛋洗净，去壳取卵清。
（2）将卵清用玻璃棒搅拌均匀，加入适量硫酸铵，搅拌至蛋白质析出。
（3）将混合液离心（3000r/min，10min），收集沉淀。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次，弃去上清液。
（5）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，得到卵清蛋白质溶液。
2. 卵清蛋白质的分离（1）将卵清蛋白质溶液用pH计测定pH值，调节至7.0。
（2）加入适量氯化钠，搅拌至蛋白质析出。
（3）将混合液离心（3000r/min，10min），收集沉淀。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次，弃去上清液。
（5）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，得到分离后的卵清蛋白质溶液。
3. 卵清蛋白质的纯化（1）将分离后的卵清蛋白质溶液用NaOH调节pH值至8.0。
（2）加入适量乙醇，搅拌至蛋白质析出。
（3）将混合液离心（3000r/min，10min），收集沉淀。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次，弃去上清液。
（5）将沉淀溶解于适量蒸馏水中，得到纯化后的卵清蛋白质溶液。
4. 卵清蛋白质的功能性质检测（1）吸水性：将纯化后的卵清蛋白质溶液滴在滤纸上，观察滤纸吸水情况。
（2）溶解性：将纯化后的卵清蛋白质溶液滴入蒸馏水中，观察溶解情况。
蛋清卵类粘蛋白的分离纯化
蛋清卵类粘蛋白的分离纯化一．实验器材1.仪器：pH计、恒温磁力搅拌器、蛋白质核酸分析仪、自动部份收集器、梯度混合器、层析柱、紫外可见光分光光度计、真空冷冻干燥机、电泳仪、电泳槽、恒温震荡摇床、透析袋、冷冻离心机、真空干燥箱、分析天平2.试剂：新鲜鸡蛋、Sephadex G-25凝胶填料、DEAE-32纤维素离子交换填料、卵类粘蛋白标品、三氯乙酸(TCA)、丙酮、氯化钠、NaH2P04、Na2HP04、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、丙烯酰氨、过硫酸胺、甘氨酸、Tris-base、十二烧基硫酸钠、乙醇、冰醋酸、碳酸氧钠、氯化铁、硫酸胺3.主要溶液的配制及材料的处理：10%三氯醋酸(pH 1.15):先把称好的TCA加总体积2/3的水溶解,再用10 mol/LNaOH调节pH至1.15,最后加水至所需体积。
0.02 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液: 先配成10倍的母液,用时稀释至0.02 mol/L;磷酸氧二钠-磷酸二氧钠缓冲液(0.02 mol/L, pH 6.5, 25℃）配制方法:0.2 mol/L 磷酸氢二钠:Na2HP04 12H20 71.64 g/1000 mL, 31.5 mL;0.2 mol/L 磷酸二氧钠:NaH2P04 2H20 31.21 g/1000 mL, 68.5 mL;胰蛋白酶标准液(0.5mg/mL):用0.001 mol/LHCl配制(每次50ml,用完再配);BAEE 底物缓冲液(内含0.05 mol/L CaCb): 用0.05 mol/L 的Tris-HCl 溶解,调pH至7.8;1 mmol/L BAEE底物溶液: 34 mg BAEE定容至100 mL底物缓冲液中,临用前配置。
Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析填料的处理: 称取30 g Sephadex G-25,用0.02mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液500 mL热溶胀2 h或者室温溶胀24 h。
生物实验操作3
0.01-1.0mg 蛋白质范围内，蛋白质与其染色后的吸光值 A959nm
成正比，可用来蛋白质定量及定性测定。
实验器材及材料
实验操作
一.卵清蛋白的提取:
1.将鸡蛋一端敲一小孔，用吸管吸取蛋白2.5毫升，加生理盐水
2.5毫升得到稀释液 2.逐滴加入饱和硫酸铵溶液5毫升（边加边搅拌，防止局部浓度 过高引起变形）静置10分钟，3000转每分钟离心10分，弃沉淀 ，取上清液。 3.再在上清液中加固体硫酸铵，至不能在溶解硫酸铵为止，静置 10分钟
在595nm处进行吸光值检测，得出的数据带入随后所得标准曲线回归方程中。
注意事项
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的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白 质。这种方法称之为盐析。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和 不易使蛋白质变性而应用最广。
实验原理
实验原理
2.考马斯亮蓝反应
蛋白质的活性测定可采用双缩脲反应、 茚三酮反应、考马斯亮蓝反应等。双缩脲反应中，除了蛋白质， 二肽以上的多肽、硫酸铵也可干扰此反应，灵敏度较差；茚三酮 反应虽灵敏，但与其发生显色反应的并不一定是蛋白质，还可能 是一些氨基酸。考马斯亮蓝染色灵敏度高，速度快，酸性环境中 其游离态呈棕红色，当与蛋白质通过疏水作用结合后成蓝色，在
4. 置于离心管中以3000转每分钟离心十分钟，弃上清液，沉淀
用5毫升生理盐水溶解（粗产品）
实验操作
二、标准曲线绘制 配制100ug/ml的牛血清白蛋白，按下表加入各试剂：
1号 2号 3号 4号 5号 6号
生理盐水 （ml）
标准牛血清蛋白 （ml） 考马斯亮蓝 （ml）
பைடு நூலகம்
1.0
0 5
0.9
实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定
实验一鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定一、实验目的：通过本实验的学习，掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定技术，掌握高速冷冻离心机、可见分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等仪器的使用。
二、基本原理：鸡卵类粘蛋白(chicken ovomucoid简称CHOM)是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。
也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。
鸡卵类粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不均一性。
目前至少已获得四种不同的组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖部分（主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上则有差别。
它们的等电点有一定的范围，大致在pH3.9~4.5。
相对分子量28，000。
卵类粘蛋白抑制胰蛋白酶克分子比为1：1，因此高纯度的卵类粘蛋白1微克能抑制相当于0.86微克的胰蛋白酶（比活力为12，000BAEE单位/毫克蛋白）。
不同来源的卵类蛋白末端基有很大差异，鸡卵类粘蛋白N—末端基为丙氨酸（C—末端为苯丙氨酸）。
卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。
鸡卵类粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。
本实验主要参照Kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，在经过DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品。
三、试剂与器材3.1粗提所需试剂：丙酮，0.5M三氯乙酸，0.2M pH6.5磷酸盐缓冲液；3.2 纯化所需试剂：0.02M pH6.5磷酸缓冲液，；DEAE-纤维素32或52，0.5M氯化钠-0.5M氢氧化钠溶液，0.5M盐酸，0.02M，pH6.5磷酸盐缓冲液,0.30M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，1.0 M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，聚乙二醇8000，蔗糖。
鸡卵粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定
鸡卵粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定潘颖，付浩亮，薛亚飞，杨海侠（河北大学生命科学学院 09生物技术，河北保定,071002）摘要：目的本实验从鸡蛋清中提取鸡卵类粘蛋白，并测定它的性质，掌握蛋白质的提取、分离纯化及性质测定技术。
方法先将鸡蛋清经三氯乙酸—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀并采用透析的方法获得粗品，再经过DEAE纤维素柱层析纯化而得到纯品。
采用BAEE法用紫外分光光度计测定粘蛋白的活性，最后用SDS—PAGE凝胶电泳法测得粘蛋白分子量。
结果粘蛋白活性为140U/m。
粗品的分子量为72310,62719,48051,34348，纯品的分子量为34493。
结论此实验所利用的方法较好，但由于操作中的失误，并未达到预期效果。
关键词：鸡卵类粘蛋白；分离纯化；透析； DEAE纤维素柱层析；SDS—PAGE凝胶电泳法The Separation and Purification of Chicken Ovomucoid and the Measurement of Chicken Ovomucoid’s Activity and Molecular Weight Pan Ying, Fu Hao-liang, Xue Ya-fei, Yang Hai-xia(Biotechnology in Grade 2009,College of Life Sciences,Hebei University,Baoding,Hebei,071002) Abstract: Objective In the experiment,firstly,we should gain the CHOM from egg white.It aim to mensurate CHOM’s activity and molecular weight..So we can acquire the technology of the experiment.Methods We should remove the egg white’desposit with TCA and ace,then acquire the gruff product from grade deposition and using dialysis,then we can get the eligibility product from DEAE cellulose column chromatography at last.After that we can measure its activity by DEAE method.We can know the mensurate protein’s molecular weight by SDS —PAGE gel electrophoresis. Results CHOM’s activity is 140U/mL.The gruff product’s molecular weight is 72337,62742,48072,34416.The eligibility product’s molecular weight is 34493. Conclusion The methods are good.As there are some faults in the experiment,we don’t have the results we want.Key words: Chicken ovomucoid(CHOM); separation and purification; dialysis; DEAE cellulose column chromatography; SDS-PAGE gel electrophoresis鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的一种糖蛋白，至今还未能获得单一组分，在电泳行为上常呈现不均一性。
鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化
鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化鸡卵粘蛋⽩的提取及猪胰蛋⽩酶的分离纯化摘要：鸡卵类粘蛋⽩是由鸡卵清中制得的⼀种糖蛋⽩，具有强烈的抑制胰蛋⽩酶的作⽤，常⽤于胰蛋⽩酶的酶学性质的研究和胰蛋⽩酶的亲和层析纯化制备。
胰蛋⽩酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋⽩酶的⼀种，EC3.4.21.4。
在脊椎动物中，作为消化酶⽽起作⽤，⽽且还能限制分解糜蛋⽩酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作⽤。
本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋⽩酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋⽩，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋⽩的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋⽩酶。
并设计了酶活性测定以对纯化过程进⾏监测和对纯化效果进⾏评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋⽩酶进⾏纯度和分⼦量的测定。
关键词：鸡卵粘蛋⽩；胰蛋⽩酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。
鸡卵粘蛋⽩（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的⼀种糖蛋⽩，⾄今还未能获得单⼀组分，在电泳⾏为上常呈现不均⼀性。
不同来源的卵类蛋⽩末端基有很⼤差别，鸡卵类蛋⽩N-末端基为丙氨酸。
卵类粘蛋⽩在中性活酸性溶液中对热和⾼浓度的脲是相当稳定的，⽽在碱性溶液中⽐较不稳定，尤其温度较⾼是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯⼄酸溶液中仍有较好的溶解度。
它们的等电点有⼀定的范围，⼤致在3.9—4.5之间。
鸡卵粘蛋⽩除对⽜和猪的胰蛋⽩酶有强烈的抑制作⽤外，对枯草杆菌蛋⽩酶也有⼀定的抑制作⽤，但对胰凝乳蛋⽩酶⽆抑制作⽤，对⼈的胰蛋⽩酶也⽆明显抑制作⽤，因此常⽤于胰蛋⽩酶酶学性质的研究。
在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋⽩酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋⽩酶进⾏分离纯化。
1材料与⽅法1.1材料与试剂市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离⼦交换纤维素，离⼦交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋⽩酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-⼆氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），，⽆⽔氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0⼄酸酸化⽔，2.5mol/L H2S04（ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/LPH2.5甲酸溶液）等。
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实验五鸡蛋清中卵类粘蛋白分离纯化及活性测定一、实验目的和要求1）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验方案。
2）设计从鸡蛋清中分离纯化卵类粘蛋白的试验操作条件。
3）了解离子交换层析系统中四大组成部分和实验主要影响因素。
4）掌握熟离子交换层析层析仪的使用方法和注意事项。
5）学会凝胶预处理和装柱、平衡、洗脱的方法。
二、器材和试剂1．实验器材：层析系统LH-2，（包括自动部分收集器，紫外检测仪，记录仪，蠕动泵，梯度混合器）6套；高速离心机；布氏漏斗；烧杯500ml,100ml，各16个；移液管1、2、5ml, 各16个；量筒50ml,100ml，各16个；真空干燥器 4个；滴管， 16个；滤纸φ120， 1盒；2．实验试剂：(1)丙酮；(2)1％，pHl.15的三氯乙酸：将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2／3总体积的蒸馏水溶解，用6mol／L氯氧化钠调至约pHl.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积；(3)0.02 mol／L,pH6.5，磷酸盐缓冲液；(4)0.5mol／L 氯化钠—0.5mol／L氢氧化钠溶液；(5)0．5mol／L盐酸溶液；(6)0.3mol/L氯化钠—0.02mol ／L磷酸盐缓冲液，pH6.5；(7)底物缓冲液：0.05mol／L，Tris-HCl缓冲液，pH8.0，内含2.22mol／L的氯化钙；(8)2mmol／1,BAEE底物：用底物缓冲液配制；(9)lmg／mL胰蛋白酶溶液：用0.001 mol／L盐酸配制；(10)DEAE-纤维素粉(DE-32)；(11)SphadexG-25；（12）鸡蛋 30个；（13）1％硝酸银三、实验原理1．蛋清中蛋白质结构组成为：卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、溶菌酶、G2、G3球蛋白、卵抑制素、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、蛋白抑制剂、抗生物素蛋白。
2．鸡卵类粘蛋白(chickenovomucoid，CHOM)的性质:鸡卵类黏蛋白(chickenovomucoid，CHOM)是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，对枯草芽孢杆菌蛋白酶也有一定程度的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。
常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。
也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。
鸡卵类黏蛋白至今还未能获得单一组分的制品，目前至少已获得4种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上差别不大，但是在糖基部分(主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸)的含量有差别。
由于Ovomucoid所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，其pI大致在3.9-4.5，相对分子质量28 000，卵类黏蛋白抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：1。
卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。
Ovomucoid带有四种糖基，因此有较强的吸水性。
在50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。
所以，选择合适的pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。
Ovomucoid 在280nm处的百分消光系数A1%1cm.280 = 4.13，即蛋白酶浓度为1mg/ml时,溶液的吸光度A280 = 0.413 ，据此可以测定其溶液中蛋白质的含量。
本实验主要参照Kassell的方法，鸡蛋清经三氯乙酸(TCA)—丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗晶，再用DEAE-纤维素柱层析纯化而得合格产品。
四、实验步骤1．鸡卵类黏蛋的提取取50mL鸡卵清，加入等体积的10％，pH1.15三氯乙酸溶液(缓缓加入以防局部过酸出现块状物)，形成类似于酸奶状的白色沉淀，轻轻地搅拌均匀。
在酸度计上检查最终pH值应为大约3.5，若pH值偏离3.5±0．2则要用5mol／L氢氢化钠或5mol/L盐酸调节pH值，由于提取液非常稠，在调节pH值时防止局部过酸或过碱。
pH值调好稳定后，在室温下静置4h以上。
待卵清清蛋白完全沉淀后，以3000r／min离心10min。
弃去沉淀物，上清液用滤纸过滤，以除去上清液中脂类物质及其他不溶物。
收集滤液转入500mL的烧杯内。
检查滤液的pH值是否为3.5，否则要调回到pH3.5。
置冰浴或冰箱内冷却片刻，缓慢加入3倍体积预冷的丙酮，用玻璃棒轻轻搅匀，用塑料薄膜盖好封严，在冰浴里放置2～4h，待鸡卵类黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出一部分上清液，剩余的部分全部转移到50mL带盖的离心杯里，加盖经平衡后以3000r／min离心15min，除去上清，沉淀物放在真空干燥器内，抽气除去残留丙酮。
使沉淀物由白转变为透明黏稠物后停止抽气。
加入20mL蒸馏水溶解，若溶解液混浊则用滤纸滤去不溶物。
滤液经SephadexG-25柱层析法脱盐或者经透析除盐。
2．鸡卵类黏蛋的脱盐用SephadexG-25柱层析法脱盐的操作如下：称取30gSephadexG-25，用500mL0.02mol／L，pH6.5的磷酸盐缓冲液在100℃热溶胀2h或者室温下溶胀24h。
脱气后装柱(35mmx300mm)，柱床体积约150mL。
用约2倍体积的0.02mol／L，pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。
流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，其A280小于0.02即可上样。
取20mL鸡卵类黏蛋白提取液上柱(上样量不超过柱床体积的1／6)。
用同样的缓冲液洗脱，收集第一峰，在蛋白峰完全流出后盐才开始流出，盐通常在280nm无明显光吸收，若绘出第二峰则是残留丙酮峰。
丙酮和盐同时流出。
洗脱曲线见下图。
3．鸡卵类黏蛋白的纯化1 2通过上述方法获得的鸡卵类黏蛋白仍含有少量的卵清清蛋白。
由于二者的等电点不同，采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。
称取10g DEAE-纤维素粉(DE-32)，用150mL 0.5 mol／L氢氧化钠-0.5mol/L氯化钠溶液浸泡20min。
用布氏漏斗(内垫为200目尼龙网)抽滤。
用蒸馏水洗至pH8．0左右，抽干。
然后移至500mL的烧杯内，用150mL0.5mol／L盐酸溶液浸泡20min，再转移到布氏漏斗内，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用150mL0.2mol／L，pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡约15min，经真空干燥器脱气后装柱。
取一支层析柱(35mmx200mm)装入约1／4体积的0.02mol／L，pH6.5磷酸盐缓冲液，将处理过的DEAE-纤维素装入柱内。
以同一缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线或经紫外分光光度计测定光吸收，待A280值小于0.02即可加样。
将经SephadexG-25脱盐后的鸡卵类黏蛋白溶液上柱吸附。
以0.02mol／L,，pH6．5的磷酸盐缓冲液平衡，基线稳定后，改用0.3mol／L氯化钠 0.2mol／L，pH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集第二洗脱峰。
柱层析图谱见上图。
在鸡卵类黏蛋白液中所含的鸡卵清清蛋白，在洗脱时可能出现一个小峰或不明显的峰形。
在这种情况下可根据峰形大小，测定活性来确定鸡卵类黏蛋白洗脱峰的位置。
4.鸡卵类黏蛋白纯品的制备经DEAE-纤维素离子交换柱层析制得的鸡卵类黏蛋白溶液装入透析袋内，用蒸馏水进行透析，间隔一段时间更换一次蒸馏水，直至经1％硝酸银检查无氯离子为止。
将透析过的鸡卵类黏蛋白溶液转移到烧杯内，小心地用1mol／L盐酸调节至pH4.0，取出lmL，稀释5～10倍测定鸡卵类黏蛋白的含量及活性。
然后加入3倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封严烧杯口，在冰浴里静置4h左右。
待鸡卵类黏蛋白完全析出后，倾去上清，沉淀转移到一个带盖的50mL离心杯内，于3000r／min离心15min，弃上清，沉淀物放人真空干燥器内干燥，即可得到透明胶状物---鸡卵类黏蛋白(约200—300mg)。
5．鸡卵类黏蛋白的含量测定配成一定浓度的鸡卵类黏蛋白溶液，测定A280。
鸡卵类黏蛋白的消光系数是：A1%1cm=4.13。
鸡卵类黏蛋白(mg／mL)=(A280╳稀释倍数)/0.4136.鸡卵类黏蛋白的活性测定 (选做)鸡卵类黏蛋白的活性可以用抑制胰蛋白酶的活力单位表示。
即：抑制1个胰蛋白酶活力单位(BAEE单位)所需卵类黏蛋白量定为抑制剂的1个活力单位。
取2个石英比色池(带盖，光程为l cm)，一个加入0.05mol／L，pH8．0 Tris-HCl缓冲液和2．0mol／L，BAEE底物溶液各1.5mL混匀，在波长253nm处调整仪器零点。
另一个比色池内加0.05mol／L，pH8.0，Tris-HCl缓冲液1.5mL，10μL胰蛋白酶液(约10μg胰蛋白酶)，10μL鸡卵类黏蛋白(约5-10μg鸡卵类黏蛋白)轻轻摇匀，在室温下(最好是在25℃恒温箱内)放置2min．如蛋白酶与鸡卵类黏蛋白充分结合。
然后加入2mol／L BAEE底物溶液1．5mL，立即混匀并记时。
于波长253mn处测定其光吸收递增值ΔA253／min。
每隔30 s读数一次，使ΔA253／min值控制在0.05左右为宜，否则要根据ΔA253／min的大小适当减少或增加鸡卵类黏蛋白的量。
以反应时间t为横坐标，A253为纵坐标作图，取直线部分的任一时间间隔与相应的光吸收变化值为ΔA253／min用A2表示。
与此同时，以同样的方法(不加鸡卵类黏蛋白：测胰蛋白酶的活性。
通过作图得到光吸收变化值ΔA253／min，用A1表示。
鸡卵类黏蛋白的抑制活性及抑制比活性的计算公式如下：鸡卵类黏蛋白的抑制活性单位(BAEE)=(A l-A2)/0.001鸡卵类黏蛋白抑制比活单位(BAEE单位/mg胰蛋白酶)=(Al-A2) ╳1000/（Al-A2）/I╳0.001 式中 A l：胰蛋白酶ΔA253／min；A2：加入抑制剂后胰蛋白酶ΔA253／min；I：测定时所用鸡卵类黏蛋白的量(μg)；1000：将抑制剂的微克数转换成毫、克数；0.001：指吸光度每增加0.001定义为1个BAEE单位。
五、注意事项1．加入丙酮沉淀在冰浴中保持4小时，注意保持冰浴状态。
2．层析柱下端过滤网孔径应与凝胶溶胀直径相匹配，防止漏胶或上下端压力差过大造成上端出水。
六、思考题1. 纯化蛋白质时如何选择离子交换树脂？2. 如何选择离子交换条件？3. 离子交换剂如何进行再生？4. 如何对基线进行调零？。