免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤

第一节免疫组化操作步骤及抗原修复(供参考)

第二节免疫组化抗原热修复得技术要点(供参考)ﻫ(一)、仪器设备

1、１８cｍ不锈钢高压锅或电炉或用微波炉、ﻫ２. 水浴锅

ﻫ(二)、试剂

1、PBS缓冲液(ｐＨ7.2―7、４)ﻫ２。0、０１ｍol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,ｐＨ6。0,1００0mｌ)ﻫ3。3%甲醇―H2O２溶液:用30%H2O2与８0%甲醇溶液配制ﻫ４、风裱剂:a.甘油与０、5mｍol/L碳酸盐缓冲液(pH9。0–9。5)等量混合 b 油与TBＳ(ＰＢＳ)配制

５.ＴＢS／ＰBＳpH９。0–９.5,适用于荧光纤维镜标本;pＨ7、０-7、4适合光学纤维标本ﻫ(三)、操作流程

1、脱蜡与水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置６0分钟或6０℃恒温箱中烘烤２0分钟。ﻫa

组织芯片置于二甲苯中浸泡１0分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟ﻫｂ无水乙醇中浸泡五分钟

c 95％乙醇中浸泡五分钟ﻫ

d 75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原修复:用于福尔马林固定得石蜡包埋组织芯片:

抗原修复(免疫组化石蜡切片)

用于福尔马林固定得石蜡包埋组织芯片需要抗原修复

福尔马林固定得组织有可能破坏了原来组织得抗原结构,蛋白多肽发生交联,导致部分抗原表位封闭,结合位点减少,所以需要抗原修复,以暴露原来得抗原表位,达到充分显露抗原,以不出现明显脱片现象为佳。

1。微波炉加热:在微波炉里加热0。０1枸橼酸钠抗原修复得几种常用方法(供参考)ﻫ

缓冲液(pＨ６.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5－10分钟,反复1-２次。根据玻片情况可参

考采用微波加热“3－5—３法”3分钟温火沸腾后静止５分钟,再温火沸腾3分钟即可。ﻫ适用得抗原:来源于人、大鼠、小鼠得组织标本;来源于其她动物种属得组织标本:

2、沸热修复: 电炉或水浴锅加热0、01M枸橼酸钠缓冲液(pH６.０)至95℃左右,放入组织芯片加热10－15分钟。

3。高压热修复:在沸水中加入EDTA(ｐH8、0)或０。01ｍ枸橼酸钠缓冲溶液(pH６。0).盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原得抗原修复。(骨及软骨组织得标本最好选择较温与得微波加热修复)

４、酶消化方法:

常用０、1%胰蛋白酶与0.4％胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热３7℃,消化时间约为5—３0分钟、适用于被固定遮蔽得抗原:

包括Ｃollaｇｅn.GFＡＰ. ｐlｅmeｎt。Cytoｋｅｒａtin.c-ｅrB－2、LＣA。LN。等

石蜡切片免疫组化染色步骤

1、三步法(以SP试剂盒为例)ﻫ●石蜡切片脱蜡至水。

●蒸馏水冲洗,ＰＢS浸泡5分钟,如果采用抗原修复,可在此步后进行。

●3％H2O２室温孵育5~１0分钟,以消除内源性过氧化物酶得活性,PBS冲洗,2分钟×３次。

●5~10%正常山羊血清封闭,室温孵育1０分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释得一抗或一抗工作液,３7℃孵育1～2小时或４℃过夜、

●PＢS冲洗,２分钟×3次。ﻫ●滴加适当比例稀释得生物素标记二抗(1％ＢSA—PBS稀释),37℃孵育１０~3０分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育１0~２０分钟。ﻫ●PBS冲

洗,2分钟×3次。

●滴加适当比例稀释得辣根酶标记链霉卵白素(PBＳ稀释),37℃孵育1０~3０分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,３7℃或室温孵育10～20分钟、ﻫ●PBS冲洗,2分钟×3次。ﻫ●显色剂显色(DAB或AEC)、

●自来水充分冲洗,复染,脱水透明、封片。

●如果必要,可选用avdin封闭内源性生物素。

2.SAＢC法

(1) 脱蜡、水化

(2)PBS洗２次各5分钟ﻫ(３)用蒸馏水或ＰBＳ配制新鲜得3％H２O2,室温封闭5－10分钟,用蒸馏水洗3次ﻫ(４)抗原修复

(5) ＰBS洗5分钟ﻫ(６)滴加正常山羊血清封闭液,室温2０分钟,甩去多余液体

(7)滴加Ι抗５0uｌ,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时

(8)PBS洗3次各2分钟ﻫ(9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃20分钟

(10)PBS洗3次各2分钟ﻫ(11)滴加试剂SABC 20℃－３0℃２0分钟ﻫ(1２)PBS洗４次各5分钟

(13) ＤＡB显色:试剂盒或自配显色剂显色

(14)脱水、透明、封片、镜检。

ﻫ冰冻切片得免疫组化染色步骤

●速冻组织ﻫ●冰冻切片4~８μm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。ﻫ●室温放置３０分钟后,入４℃丙酮固定１0分钟、也可根据需要选择其她得固定方式。ﻫ●ＰBS冲洗,5分钟×3次、ﻫ●用3％过氧化氢孵育5～10分钟,消除内源性过氧化物酶得活性。

●PＢS冲洗,5分钟×3次。

●下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。

第二节免疫组化抗原热修复得技术要点(供参考)

1、抗原热修复温度与时间得关系

我们日常工作中所使用得组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间得亚甲基发生桥连,具体过程如下:ﻫ第一步基本反应福尔马林与氢反应形成新得化合物

第二步基本反应福尔马林与氢反应形成新得亚甲基桥ﻫ上述反应得结果导致许多抗原决定簇被封闭,而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复得两个最关键得因素就是温度与时间,有人将这两种因素对抗原修复得影响总结为下面得公式:

抗原热修复得有效性＝加热温度(Ｔ) ×加热时间(t)

也就就是说当我们修复时得温度越低则需要修复得时间就越长;反过来当修复温度增高时修复得时间可以适当地缩短,才能使抗原决定簇完全暴露,这种反比得关系从MBI单克隆抗体得实验结果表1中也可以清楚地瞧出。

时间与温度对染色得影响

时间(分钟)

1０0℃80℃６0℃

6 + + + + ++ ＋―

×

5×２ + + ＋――ﻫ5

5×10 ―＋++ ＋ +

1０小时―― + +

如果修复强度不够,免疫组织化学染色所显示得只能就是修复后暴露得部分抗原决定簇,而不就是组织所含得全部抗原、这样得染色结果可能会非常弱,或出现假阴性,即使就是阳性结果,充其量只能起到定性得作用,不能适应今后对免疫组化进行定量得需要。这就给我们诊断中定量指标得应用带来困难,例如用来测定耐药得指标。

2、组织固定时间与所需得抗原热修复得关系ﻫ大量得实验表明,固定时间越长得标本,它所形成得桥连就越紧密,抗原就越难以被激活,所需要得修复强度也就越强。有意思得就是随着固定时间得延长,组织中蛋白对温度得耐受也相应增高(如图1所示),这可能就就是我们对固定时间长得标本加大修复强度得理论基础。