胶体金标记技术
免疫胶体金技术
The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing. Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size . The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.
. 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大
How are the antibodies coupled to the gold?
Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena : a). ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protein b). hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface c). Sulfur binding (Cysteine and Methionine)
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.
《免疫胶体金技术》课件
简便操作
免疫胶体金技术操作简便，不需要复 杂的仪器和设备，降低了对实验条件 和技术的要求。
VS
该技术适用于基层医疗机构、实验室 及家庭自测等多种场景，方便快捷， 易于推广应用。
稳定性好
免疫胶体金技术稳定性好，试剂有效期长，可长时间保存，保证了检测结果的稳定性和可靠性。
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目 录
• 免疫胶体金技术概述 • 免疫胶体金技术的制备 • 免疫胶体金技术的特点与优势 • 免疫胶体金技术的应用实例 • 免疫胶体金技术的挑战与前景
01
免疫胶体金技术概述
定义与原理
总结词
简述免疫胶体金技术的定义和基本原理。
详细描述
免疫胶体金技术是一种基于胶体金标记的免疫分析方法，利用胶体金作为示踪标记物，结合抗原抗体反应进行检 测和定量分析。其原理基于抗原抗体反应的特异性和胶体金的颜色变化，实现对目标物质的快速、灵敏和可视化 检测。
组装质控线
在硝酸纤维素膜上固定另一种 抗原或抗体，形成质控线。
组装试剂条
将硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸 和吸水纸按顺序粘贴成试剂条
。
质量检测与控制
外观检查
观察试剂条是否平整、无破损、颜色均匀。
稳定性检测
在不同温度和湿度条件下存放试剂条，观察 其稳定性。
性能测试
通过与已知浓度的标准品进行对比，检测试 剂条的灵敏度和特异性。
历史与发展
总结词
概述免疫胶体金技术的发展历程和重要突破。
详细描述
免疫胶体金技术最早可追溯到20世纪70年代，随着科学家对胶体金和免疫学研究的深入，该技术逐渐 发展成熟。近年来，免疫胶体金技术不断取得突破，在临床诊断、生物安全检测、食品安全检测等领 域得到广泛应用。
胶体金免疫标记原理
胶体金免疫标记原理咱先得知道啥是胶体金呢。
胶体金啊，就像是一群超级小的金粒子在溶液里开派对。
这些金粒子小得不得了，直径也就几个到几十个纳米。
它们在溶液里形成一种胶体状态，就像一群小精灵在水里欢快地游来游去。
胶体金有个很厉害的特性，就是颜色特别好看，不同大小的胶体金粒子还会呈现出不同的颜色呢，从酒红色到紫红色都有。
那这胶体金和免疫标记咋就联系上了呢？这就像是给胶体金找了个特殊的工作。
免疫标记呢，简单说就是要把能识别特定东西的抗体或者抗原给标记出来。
咱们身体里有免疫系统，抗体就像一个个小卫士，专门去识别那些外来的坏家伙，也就是抗原。
胶体金免疫标记就是把胶体金和抗体或者抗原结合起来。
想象一下啊，胶体金粒子就像一个个小珠子，抗体就像小钩子。
咱们通过一些巧妙的化学方法，就把小钩子挂到小珠子上啦。
这个过程就像是给小珠子穿上了一件有特殊功能的衣服。
当我们要检测一个样本里有没有特定的抗原或者抗体的时候，这个胶体金标记就大显身手了。
比如说我们怀疑一个样本里有某种病毒，这种病毒就是抗原啦。
我们把胶体金标记的抗体放进去，如果样本里有这个病毒，那标记了胶体金的抗体就会像找到目标的小导弹一样，“嗖”地一下就和病毒结合在一起。
然后呢，因为胶体金有颜色呀，一旦结合了，我们就能看到颜色的变化。
就好像是小珠子和病毒结合之后，它们就开始发光发亮，告诉我们：“我们找到目标啦！”如果没有那种病毒，那标记的抗体就找不到结合的对象，就不会有那种特殊的颜色变化。
这个胶体金免疫标记还有很多优点呢。
它操作起来比较简单，不需要那些特别复杂的仪器。
就像咱们做手工一样，只要按照步骤来，很容易就能完成检测。
而且它检测速度还挺快的，就像短跑运动员一样，很快就能出结果。
再说说这个胶体金免疫标记在实际生活中的应用吧。
在医疗领域，它可帮了大忙了。
比如说检测传染病，像新冠疫情的时候，胶体金法的检测试剂就发挥了不小的作用呢。
它能快速地检测出一个人是不是感染了新冠病毒。
胶体金免疫标记技术
胶体金免疫标记技术胶体金免疫标记技术一、胶体金的制备一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm 范围内。
范围内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。
使用不同种类、使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。
即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。
还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。
但体积也越小。
但体积也越小。
粒子直径每增加一倍，数量减少为粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm 的胶体金。
因此一般胶体金探针均使用该方法进行。
但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。
此时在溶液中添加此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。
双标记或制备5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。
的胶体金时建议使用该方法。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm 直径的胶体金。
但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。
因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 12-16 nmnm 直径的胶体金。
金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，题，但所形成的金粒子体积变化较大。
磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法故该方法已经很少使用。
已经很少使用。
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或1g ），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 1.5 ml ml 试管分装为1 1 ml ml 保存（-20℃）。
hiv胶体金法原理
HIV胶体金法（HIV colloidal gold assay）是一种常用于检测人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的诊断试剂盒。
它基于胶体金技术，利用特定抗原与HIV抗体之间的免疫反应来检测HIV感染。
该方法的原理如下：
1. 准备试剂：试剂盒中包含两个主要组分：胶体金颗粒和特定的HIV 抗原。
胶体金颗粒是微小的金纳米颗粒，其表面被某种生物活性物质包覆，使其呈现出稳定的胶体状态。
特定的HIV抗原则能与HIV感染者体内产生的抗体发生特异性结合。
2. 样本处理：将待测血清或血浆样本与试剂中的HIV抗原混合，使其充分接触。
3. 抗原-抗体结合：如果样本中存在HIV抗体，那么它们将与试剂中的HIV抗原发生特异性结合。
这种结合形成了抗原-抗体复合物。
4. 胶体金标记：在抗原-抗体复合物形成后，胶体金颗粒会与复合物结合，形成更大的复合物。
这一过程被称为胶体金标记。
5. 可视化结果：将混合物滴在试剂盒提供的试纸上，胶体金颗粒会沿着试纸流动。
当复合物通过试纸上的检测线时，复合物中的胶体金
颗粒会与试纸上固定的抗体发生结合，形成可见的彩色线条。
如果样品中存在HIV抗体，则出现相应的阳性结果线条。
否则，只会显示一个阴性结果线条。
通过观察试纸上的线条形成情况，可以初步判断样本是否含有HIV抗体，从而进行HIV感染的初步筛查。
需要注意的是，HIV胶体金法是一种辅助诊断方法，阳性结果需要进一步进行确认和确诊。
免疫胶体金技术
面临挑战与解决策略
技术挑战
提高胶体金的合成效率、稳定性和生物相容性，降低生产成本，推动技术的实际应用。
应用挑战
拓展免疫胶体金技术在生物医学领域的应用范围，提高其在实际应用中的准确性和可靠 性。
法规与伦理挑战
建立健全相关法规和标准体系，规范免疫胶体金技术的研发和应用，确保其安全性和有 效性。同时，关注伦理问题，尊重人类生命和尊严，推动技术的健康发展。
环境毒理学研究
毒性评估
利用免疫胶体金技术，可以研究 环境污染物对生物体的毒性作用 ，评估其对生态系统和人类健康
的影响。
毒理机制研究
该技术可用于揭示环境污染物与生 物体相互作用的分子机制，为环境 毒理学的深入研究提供有力工具。
污染物代谢研究
通过免疫胶体金技术，可以研究环 境污染物在生物体内的代谢过程， 了解其在生物体内的转化和排泄途 径。
食品营养成分分析
蛋白质检测
利用免疫胶体金技术，可以准确测定食品中的蛋白质含量，为食品 的营养价值评估提供依据。
维生素检测
该技术可用于食品中多种维生素（如维生素A、维生素E等）的定量 分析，有助于评价食品的营养成分组成。
矿物质检测
通过免疫胶体金技术，可以检测食品中的矿物质元素含量，如钙、铁 、锌等，为食品的营养价值提供全面数据。
02
免疫胶体金制备技术
原料选择与处理
01
02
03
氯金酸的选择
选择高纯度的氯金酸作为 原料，确保胶体金的合成 质量。
还原剂的选择
常用还原剂如柠檬酸三钠 、抗坏血酸等，用于将氯 金酸还原为金颗粒。
溶液配制
将氯金酸溶解在适量超纯 水中，配制成一定浓度的 氯金酸溶液。
胶体金合成方法
胶体金标记抗体技术实验原理
胶体金标记抗体技术实验原理胶体金标记抗体技术是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将介绍胶体金标记抗体技术的实验原理。
胶体金是一种具有特殊光学性质的纳米材料，其颗粒大小约为5-100纳米。
在胶体金标记抗体技术中，将胶体金颗粒与抗体分子进行特异性结合，使抗体的检测变得更加灵敏和准确。
实验过程中，首先需要制备胶体金溶液。
一般采用氢氯酸还原法，将金盐溶液与还原剂混合后，通过调节pH值和温度等条件，使金离子还原生成金纳米颗粒。
随后，通过离心等方式将胶体金颗粒分离出来，并进行洗涤和稳定处理。
接下来，需要将抗体与胶体金颗粒进行结合。
这一步骤需要将抗体分子与胶体金表面的化学官能团进行共价结合或吸附结合。
共价结合一般采用交联剂如戊二醛等进行，而吸附结合则是通过静电作用或亲疏水性相互作用实现的。
结合完成后，可以对标记的抗体进行检测。
常用的方法包括光谱分析、电化学分析和显微镜观察等。
通过测定胶体金颗粒的表面等离子共振吸收峰位移、电流变化或颗粒颜色变化等参数，可以定量或定性地检测目标物质的存在与否。
胶体金标记抗体技术的原理基于胶体金颗粒特殊的光学性质。
胶体金颗粒在可见光波长范围内具有很高的吸收和散射能力，这是由于表面等离子共振现象的存在。
当胶体金颗粒与抗体结合后，抗体的特异性识别能力可以将胶体金颗粒引导到目标分子的位置。
这种结合可以通过光谱分析等方法进行定量或定性检测。
胶体金标记抗体技术具有许多优势。
首先，胶体金颗粒具有较高的物理化学稳定性和生物相容性，可以在生物样品中稳定存在。
其次，胶体金颗粒的表面容易与抗体等生物分子进行结合，使得标记过程简单方便。
此外，由于胶体金颗粒的尺寸可调控性较好，可以通过调节颗粒大小来实现信号放大效应，提高检测的灵敏度。
总结起来，胶体金标记抗体技术是一种重要的生物分析技术，其原理是利用胶体金颗粒的光学性质和抗体的特异性识别能力进行目标物质的检测。
通过合理设计实验方案和优化实验条件，可以实现高灵敏度、高选择性和低成本的生物分析。
胶体金标记抗体的方法
胶体金标记抗体的方法
论文题目：胶体金标记抗体的方法
一、背景介绍
胶体金标记抗体技术是一种用于识别特定的抗原分子的技术，经常用于实验，特别是免疫组织化学实验，因为它可以使实验处理变得非常容易和简单。
利用胶体金标记抗体技术，可以可靠的识别和定位细胞内外的抗原物质，由此可以定位抗原的生物功能。
改变标记抗体的发光属性，使得研究者可以使用它来测量抗原的广泛性和准确性，比如表观遗传的分布及活性等。
二、胶体金标记抗体的基本原理
胶体金标记抗体技术是将猪胰抗体固定到表面的胶体金粒子上，这些抗体除了能够和其特殊抗原结合之外，还可以结合各种抗原，使得它们可以同时具有多种抗原的识别能力，而不必更换抗体。
三、胶体金标记抗体的方法
1.准备胶体金标记抗体
首先需要准备好抗体，抗体需要具有较强的稳定性，能够长期稳定保存。
抗原物质可以通过血清或免疫实验中获得，此外，免疫实验也可以检测出异常表达抗原。
2.培养胶体金标记抗体
培养抗体需要使用胶体金粒子，这些粒子可以通过电离法制备。
制备好的胶体金粒子可以用来培养抗体。
培养抗体需要将抗体溶液稀释到一定浓度，然后将稀释好的抗体注射到胶体金粒子表面，使得抗
体结合到胶体金粒子表面上。
3.加入抗原
将抗原溶液加入胶体金标记抗体溶液，使抗体和抗原结合，产生特定的复合体。
4.检测抗原
完成抗原结合到胶体金标记抗体上之后，可以使用荧光显微镜或免疫荧光来检测结合的抗原，从而得到抗原的准确位置。
四、结论
胶体金标记抗体技术可以有效的识别不同抗原的位置，使得实验处理变得更加容易，并且效果也得到改善。
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胶体金标记的实验操作
（时间:2008-5-28 18:05:38）
（1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备
胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。
如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。
除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。
1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。
2）待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。
标记IgG 时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10。
由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。
必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
（2）蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定
1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。
2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～
50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。
对照管只加1ml稀释液。
3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。
4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。
以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。
将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。
（3）标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合
将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。
常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。
加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。
在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
下述标记步骤最为常见：
①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为2～3ml），搅拌2～3分钟。
③加入5ml1%PEG20000溶液。
④于10000～100000g离心30～60分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。
⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A1cm/540nm=1.5左右为宜，以0.5mg/ml叠氮钠防腐，置4℃保存。
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。
通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
（4）胶体金标记蛋白的纯化
1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。
用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。
然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。
仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA 的PB液（含0.02%NaN3），将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。
如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。
为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%～30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。
2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。
将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5～1/10。
再经1 500r/min离心20min。
取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。
层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。
按红色深浅分管收集洗脱液。
一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。
继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。
将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。
最终可得到70%～80%的产量。
胶体金蛋白结合物的质量鉴定
（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。
或用醋酸铀复染后观察。
计算100个金颗粒的平均直径。
（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。
用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1%BSA，0.02%NaN3）将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD520＝0.25左右。
一般应用液的OD520应为0.2～0.4。
（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。
将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。