滋养层细胞的制备
嵌合体的制备
嵌合体的制备嵌合体偶尔在妊娠期间可自然产生，但大部分是人工制作的。
目前，制作嵌合体的方法有两种，即聚合法（包括早期胚胎聚合法和卵裂球聚合法）和囊胚内细胞团（inner cell mass，ICM）注入法，可根据实验目的和实验条件进行选择。
（一）囊胚注入法囊胚注入法指，当动物胚胎发育到囊胚，即分化为两种明显不同的组织：内细胞团和滋养层细胞时，将目的细胞或细胞团注入囊胚腔，使之与内细胞团结合并发育，最终得到嵌合体个体的方法。
注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、EC细胞、ES细胞、EG细胞，甚至是已经分化了的细胞。
此外，也有人将某一囊胚的ICM完全用另一囊胚的ICM代替，这种方法称之为囊胚重组，曾被成功地用来进行种间怀孕，制备的嵌合体为胎儿的周围组织来自另外一种动物。
这种方法可广泛应用于研究基因型已知的ICM的发育能力和具有不同基因型的滋养层细胞之间在个体发育中的相互关系。
此法最早由Gardner于1968年提出，经过多方改良，成功率较高，适用范围较广，可用于种内或种间嵌合，供体和受体的发育阶段可同步，也可以不同步，它还适用于不能去透明带的动物，如兔等。
该法是将几个ES细胞（一般5～15个）注入囊胚腔中。
但囊胚注射法需要购买昂贵的仪器（显微操作仪等），而且技术难度较大，需要一定的时间才能掌握，不利于一般的推广。
该方法适用于研究细胞的发育潜能和胚胎的调整能力；注射细胞可获得较高的嵌合体效率，有可能对每个细胞的命运做较为详细的分析；适用于胚胎稀少的，经济价值高的动物嵌合体的制作；这种方法的突出作用是为应用ESC制作嵌合体奠定了基础。
（二）聚合法1.聚合法的分类用聚合法制作嵌合体，操作简便，不需要特殊的仪器设备，是一种常用的嵌合体制作方法，尤其是在没有试验条件利用囊胚注入法来制作嵌合胚和嵌合体动物的情况下，更是一种有效的方法，利于掌握和推广。
根据聚合对象的不同，可分为以下3种。
（1）胚胎聚合法：该方法指的是将发育到一定时期（一般为8-细胞至桑椹胚）的胚胎去掉透明带后，将两个或两个以上的胚胎聚合，形成一个胚胎后体外培养至囊胚，再移植入受体动物体子宫内，最终获得嵌合体个体的方法。
人早孕绒毛滋养层细胞原代培养:差异贴壁法与消化排除法联合应用的可行性
人早孕绒毛滋养层细胞原代培养：差异贴壁法与消化排除法联合应用的可行性张小红;李玉红;许倩;任春丽【摘要】背景:国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的体外培养方法,大多步骤繁琐,细胞纯度低而且成本很高,不适于普通实验室推广应用.目的:拟求建立一种人妊娠5～10周绒毛滋养层细胞简便有效的分离培养及鉴定方法.方法:采用改进的胰酶消化法分离培养妊娠5～10周人绒毛滋养层细胞,加0.0625%胰酶,37℃消化25～40 min;以差速贴壁法和消化排除法纯化细胞,倒置显微镜观察细胞形态,细胞免疫化学方法鉴定细胞来源和纯度.结果与结论:倒置显微镜下原代培养滋养层细胞接种后见大量圆形细胞悬浮存在,1h后可见部分细胞贴壁,24h后70%～80%细胞贴壁,五六天细胞数量明显增多,细胞呈三角形、多边形平铺片状生长,核大卵圆形居中,部分细胞连接成片,部分细胞呈长梭形.七八天长满瓶壁的80%～90%可传代.9～10d铺满培养瓶底部.细胞碎屑不贴壁.传代接种后1.5 h贴壁,迅速增长,三四天爬满瓶底,各代细胞形态基本一致.可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达70%～80%.采用低浓度胰酶进行长时间消化分离培养人早孕绒毛滋养层细胞,利用差异贴壁法和消化排除法以及反复换液法进行纯化,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养层细胞.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)028【总页数】4页(P5220-5223)【关键词】滋养层细胞;细胞培养;细胞纯化;细胞鉴定;绒毛组织【作者】张小红;李玉红;许倩;任春丽【作者单位】承德医学院,河北省承德市,067000;承德医学院,河北省承德市,067000;承德医学院,河北省承德市,067000;承德医学院附属医院,河北省承德市,067000【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言人胎盘绒毛膜滋养层细胞对研究胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制有很重要的生物学意义[1-5]。
饲养层细胞、成纤维细胞、滋养层细胞
中文名称：饲养层细胞大鼠胚胎干细胞在饲养层细胞上培养英文名称： feeder layer cell定义：在细胞培养中起分化抑制作用的单层贴壁细胞所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）所谓饲养层细胞就是指一些特定细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞），经有丝分裂阻断剂（常用丝裂霉素）处理后所得的细胞单层。
是细胞培养，尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂。
成纤维细胞成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。
根据细胞不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小体着色深，核仁不明显，细胞质少。
此二型细胞可互相转化。
在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。
通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位。
在国王学院研究人员一项针对小鼠的研究中，发现小鼠皮肤中的成纤维细胞至少有两种类型：一种是结缔组织上层的成纤维细胞，它们是皮肤毛囊形成所必须；另一种则是结缔组织下层中的成纤维细胞，这部分细胞负责制造大部分的皮肤胶原纤维，触发受损皮肤的修复。
通过皮肤表皮信号的刺激可增加成纤维细胞的数量，而成纤维细胞数量的增多有助于伤口愈合过程中毛囊的形成，进而降低皮肤愈合后落下疤痕的几率。
研究表明，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，假设找到方法刺激这些细胞生长，就有可能恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。
《牛类滋养层干细胞建系的研究》范文
《牛类滋养层干细胞建系的研究》篇一一、引言随着生物医学的飞速发展，干细胞研究已经成为生命科学领域的研究热点。
牛类滋养层干细胞作为一类具有多向分化潜能的细胞，在农业生产和人类医学研究中都具有重要意义。
然而，其研究进程受到了获取难、体外建系困难的限制。
本文将重点阐述牛类滋养层干细胞的建系方法、关键步骤以及研究成果。
二、牛类滋养层干细胞的基本特征与意义牛类滋养层干细胞（Bovine Trophoblast Stem Cells，BTSCs）是一种具有多潜能性的细胞，可分化为多种细胞类型，如胚胎滋养层细胞、巨噬细胞等。
这些细胞在牛的胚胎发育过程中发挥着重要作用。
此外，由于其在医学领域具有潜在的应用价值，如治疗组织损伤、再生医学等，因此对牛类滋养层干细胞的建系研究具有重要意义。
三、牛类滋养层干细胞的建系方法与关键步骤（一）材料与仪器在建立牛类滋养层干细胞系时，需使用到新鲜的牛胚胎滋养层组织、细胞培养基、酶类物质等实验材料，以及倒置显微镜、离心机、培养箱等实验仪器。
（二）实验步骤1. 分离和纯化：通过手术或实验室操作获取新鲜的牛胚胎滋养层组织，然后进行分离和纯化，得到单细胞悬液。
2. 培养：将单细胞悬液接种于含有适宜生长因子的培养基中，进行体外培养。
3. 筛选：通过特定的筛选方法，如流式细胞术等，筛选出具有多潜能性的细胞。
4. 建系：经过多次传代培养和筛选后，建立稳定的牛类滋养层干细胞系。
（三）关键点分析在建立牛类滋养层干细胞系的过程中，需要注意以下关键点：1. 分离和纯化过程中需保证操作的无菌性，避免污染；2. 培养基的配制需根据细胞生长需求进行优化；3. 筛选过程中需注意筛选出具有多潜能性的细胞；4. 建立稳定的细胞系需多次传代培养和筛选。
四、研究成果与展望经过深入研究和实践，我们已经成功建立了牛类滋养层干细胞系。
通过对这些细胞进行基因编辑和分化诱导等实验操作，我们成功证明了其具有多向分化的潜能。
这些成果为进一步研究牛类滋养层干细胞的生物学特性和其在医学领域的应用提供了重要基础。
滋养层细胞相关实验设计
反复流产项目细胞相关试验设计一、反复流产相关背景反复性自然流产（RSA）是指自然流产连续发生3次或以上者，过去常称习惯性流产。
现多认为，连续2次或2次以上的自然流产也可称为反复性自然流产，在育龄妇女中的发病率约为1% ～5%。
RSA病因不明确并且可能是多因素的，一般公认的病因包括：免疫因素、遗传因素、内分泌因素、子宫解剖异常、感染因素、微量元素环境因素和心理及应激因素等。
目前认为与免疫因素相关表现为母体排斥胎儿，其中涉及到人类白细胞抗原、血型抗原滋养层细胞膜抗原、封闭抗体、抗生殖免疫抗体、细胞因子、胞间粘附分子、补体功能紊乱等多种因素。
在正常的妊娠过程中，胚胎与母体之间形成母-胎界面，母-胎界面主要由来自胚胎的滋养细胞及来自母体的蜕膜组织组成。
母-胎界面细胞类型主要包括来自胚胎的滋养细胞及来自母体的蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞以及免疫细胞，其中蜕膜基质细胞（DSC）约占蜕膜细胞总数的75%，早孕期免疫活性细胞占蜕膜细胞总数的15%，其中70%以上的蜕膜免疫细胞为CD56bright CD16-NK细胞，其余为T细胞和巨噬细胞，几乎没有B细胞。
母体在妊娠早期形成母-胎界面免疫耐受微环境，使胎儿及其附属物不被母体排斥并可在子宫内发育成熟。
免疫耐受的维持主要通过免疫调节细胞如蜕膜基质细胞（DSC）、蜕膜NK细胞、Treg细胞、滋养细胞等。
早期妊娠（妊娠第一期）DSC由非孕子宫内膜成纤维细胞样前体细胞受雌、孕激素作用后分化而来，DSC具有广泛的生物学功能，除参与蜕膜营养供给外，尚能分泌活性激素如泌乳素、多种细胞因子和酶类，表达孕激素受体，调节胚泡着床和胚胎发育，并作为以一种免疫潜能细胞，参与抗原提呈和分泌细胞因子，而发挥重要的免疫调节作用。
成熟的DSC可产生大量的纤维连接蛋白（fibronectin）、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Haparan sulfate proteoglycan，HSP）、Ⅳ型胶原以及层粘连蛋白（laminin），形成妊娠期特殊的ECM （细胞外基质），以供滋养细胞在其中迁移、游走。
《牛类滋养层干细胞建系的研究》范文
《牛类滋养层干细胞建系的研究》篇一一、引言牛类滋养层干细胞（Bull Trophoblast Stem Cells，简称BTSCs）在动物生殖生理学、细胞生物学和生物医学等多个领域中具有重要的研究价值。
本文将探讨牛类滋养层干细胞的建系过程，并就其可能带来的科学应用与意义进行阐述。
二、研究背景与意义牛类滋养层干细胞是指来源于牛胎盘的滋养层组织，具有分化成多种组织的能力的特殊干细胞。
该细胞因其具备自更新、多潜能性等特点，在医学领域具有广泛的应用前景，如用于治疗人类疾病、组织修复等。
因此，建立稳定的牛类滋养层干细胞系，对于研究其生物学特性、分化机制以及在医学领域的应用具有重要意义。
三、研究方法1. 样本采集：选择健康且处于孕期的母牛，于适宜时间点采集其胎盘组织。
2. 细胞分离与培养：利用适当的酶消化法分离胎盘组织中的滋养层细胞，然后进行体外培养。
3. 建系过程：通过连续传代、优化培养条件等方法，建立稳定的牛类滋养层干细胞系。
4. 细胞鉴定：利用分子生物学技术，对建立的干细胞系进行鉴定，确保其为牛类滋养层干细胞。
四、建系过程及结果1. 细胞培养：在适宜的培养条件下，滋养层细胞逐渐适应体外环境并开始增殖。
2. 传代与克隆形成：经过多次传代后，部分细胞形成克隆，这些克隆具有干细胞的特性。
3. 建系成功：经过优化培养条件和连续传代，最终建立了稳定的牛类滋养层干细胞系。
4. 细胞鉴定结果：通过分子生物学技术鉴定，证实所建立的细胞系为牛类滋养层干细胞。
五、讨论1. 建系过程中的关键因素：包括样本采集、细胞分离与培养、传代与克隆形成等环节的优化，对于建立稳定的牛类滋养层干细胞系至关重要。
2. 细胞特性的研究：通过研究牛类滋养层干细胞的生物学特性、分化能力等，可以进一步了解其在医学领域的应用潜力。
3. 未来研究方向：未来可进一步研究牛类滋养层干细胞的分化机制、调控网络以及在疾病治疗、组织修复等方面的应用。
六、结论本文成功建立了稳定的牛类滋养层干细胞系，为研究其生物学特性、分化机制以及在医学领域的应用提供了有力支持。
滋养层细胞的分离培养与鉴定
滋养层细胞的分离培养与鉴定王海霞;李金枝;解其贵;杨瑜;董凌云;左绪磊【摘要】目的:培养符合实验要求的人绒毛滋养层细胞.方法:胰蛋白酶、胶原酶消化绒毛组织,进行原代培养,用胰蛋白酶消化法进行传代培养并纯化.观察其形态学特征并绘制生长曲线,计算倍增时间.应用光镜、免疫荧光进行细胞鉴定.Transwell小室法检测其体外侵袭能力.结果:原代培养滋养层细胞24 h贴壁,7～10 d首次传代,倍增时间3.42 d,细胞表达细胞角蛋白7而不表达波形蛋白.结论:胰蛋白酶、胶原酶消化法可获得符合实验要求的人绒毛滋养层细胞,能建立稳定的人绒毛滋养层细胞体外培养体系.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2010(017)005【总页数】3页(P724-726)【关键词】滋养层细胞;体外培养【作者】王海霞;李金枝;解其贵;杨瑜;董凌云;左绪磊【作者单位】复旦大学附属金山医院妇产科,上海,200540;复旦大学附属金山医院妇产科,上海,200540;复旦大学附属金山医院妇产科,上海,200540;复旦大学附属公共卫生中心科研部,上海,201508;复旦大学附属金山医院妇产科,上海,200540;复旦大学附属金山医院妇产科,上海,200540【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1AbstractObjective:To culture human first trimester cytotrophoblasts in vitro.Methods:Human first trimester cytotrophoblasts were isolate,purify and culture.The morphology characteristics were detected through microscopy,we drew growth curve and calculated the doubling time to describe its growth characteristics.Immunofluorescence was carried out to determined the expression of cytokine7and vimintin.Results:The cells adherence achieved24-48hours after seeding,7-10days later the cells were subcultured for the first time.The doubling time of cell populationwas3.4days.The cell populations expressed cytokeratin7but not vimentin.Transwell invasion experiment showed that the invasive capability remained in vitro.Conclusions: Typsin-collagenase digestion process can obtain human trophoblastic cells and also can establish a stable human trophoblastic cells culture systerm in vitro.Key WordsFirst trimester cytotrophoblasts; In vitro目前,对人绒毛滋养层细胞的生物学行为及机制的体外研究越来越多,而人绒毛滋养细胞的原代培养是进行这类研究的基础。
一种NK滋养层细胞及其应用[发明专利]
![一种NK滋养层细胞及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6f67d4ecd05abe23482fb4daa58da0116d171f4a.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110113588.1(22)申请日 2021.01.27(71)申请人 河南省华隆生物技术有限公司地址 453000 河南省新乡市新飞大道1789号高新区火炬园(72)发明人 赵礼军 熊建民 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 5/10(2006.01)C12N 15/867(2006.01)C12N 15/12(2006.01)C12N 15/24(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 5/0783(2010.01) (54)发明名称一种NK滋养层细胞及其应用(57)摘要本发明提供了一种NK滋养层细胞及其应用，所述NK滋养层细胞表达细胞因子组合物，所述细胞因子组合物包括CD86、CD19、IL ‑21、CD137L和CD64；所述CD86包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组载体、一种重组慢病毒、所述NK滋养层细胞的制备方法和一种NK细胞培养基。
通过构建重组载体，包装得到重组慢病毒后，再导入宿主细胞的基因组内，制备得到的NK滋养层细胞可以持续分泌刺激NK细胞增殖与分化的相关蛋白，实现了NK细胞的高效率、低成本扩增，制备方法简单高效，具有广阔的应用前景。
权利要求书2页 说明书11页序列表9页 附图3页CN 112725284 A 2021.04.30C N 112725284A1.一种NK滋养层细胞，其特征在于，所述NK滋养层细胞表达细胞因子组合物，所述细胞因子组合物包括CD86、CD19、IL‑21、CD137L和CD64；所述CD86包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的NK滋养层细胞，其特征在于，所述CD19包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；优选地，所述IL‑21通过与CD8α跨膜区融合形成IL‑21‑CD8α表达在所述NK滋养层细胞表面；优选地，所述IL‑21‑CD8α包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；优选地，所述CD137L包括SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；优选地，所述CD64包括SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。
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1．器材
眼科镊子；眼科剪；平皿；200目筛；小烧杯；细胞计数板；离心管2．试剂
双抗；DMEM(DMEM/F12)；FBS；胰蛋白酶(0.25%)；Ⅰ-胶原酶(0.1%)；PBS；75%酒精；0.4%台盼蓝；
3．方法步骤
3.1．滋养层的分离
(1)将剥离下的组织放入75%酒精中10s，用含双抗的PBS冲洗2次，取出组织放入含有双抗的PBS缓冲液中，4℃保存，6-8 小时内带回实验室。
(2)将采集的胎盘样品用75%的酒精表面消毒后迅速的移入到新鲜的含双抗的PBS缓冲液中冲洗2-3次，移入无菌间内的超净工作台内。
无菌双抗PBS缓冲液冲洗3 次，用眼科剪小心剥离胎膜、尿囊膜、毛细血管等与绒毛膜紧密相连组织，无菌双抗PBS缓冲液冲洗3次。
(3)用眼科剪剪成1-3mm3的组织小块，含双抗的PBS悬浮沉淀漂洗3 次，每次3 min。
加入等体积于组织样品的0. 25 %胰蛋白酶消化液，37℃恒温震荡箱消化10 min，弃上清。
再加入等样品20-30 倍的0.25%胰蛋白酶和0. 1 %胶原酶1:1 复合消化液，37℃消化30 min，收集上清液。
将剩余组织再次加入复合消化液 5 min，直至大部分组织被消化成细胞悬液，收集每次消化后的上清液加入等体积含10%血清的培养基终止消化。
(4)将所得到的细胞悬液通过200 目的不锈钢筛网。
(5) 1200 r/min,离心5 min,用完全培养基重悬离心沉淀的细胞,将细胞悬液浓度调整至5~6X105个/mL。
(6)置于37℃5% CO2培养箱中培养；隔日更换培养基一次以去除血细胞和其它无法贴壁的成分，待细胞贴壁后更换培养液，此后每3d 更换培养液1 次。
直至首次传代。
3.2．滋养层的纯化与传代
纯化过程与传代培养同时进行。
当原代培养的滋养层细胞贴壁生长到90%以上汇合度时应进行传代。
首次传代前24 小时更换培养液。
(1)反复贴壁法
将原代培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶消化后，制成不含血清的细胞悬液，接种到培养瓶内，静止20 min；镜下观察部分细胞贴壁（稍加摇荡也不浮起），由于在无血清培养液内成纤维细胞比上皮细胞贴壁快，此时的贴壁细胞主要为成纤维细胞，上皮细胞大多数悬浮在培养液内，然后将培养液（含未贴壁细胞）吸到另一培养瓶内，加入含血清的培养液继续培养；再次制备不含血清的细胞悬液，重复以上操作传代培养3 次，可获得较高浓度的胎盘滋养层细胞。
(2)消化排除法
将原代培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶消化液（含0. 02% EDTA）加入培养的细胞中，镜下见纤维样细胞缩短变圆，部分细胞脱壁，立即加入含有血清的培养液终止消化。
轻轻振摇培养瓶后，倒掉液体，用含血清的培养液清洗瓶内贴壁的细胞，最后向瓶内加入含血清的培养液后继续培养，等下次传代时重复以上操作。
这样重复传代 5 次即可
得到纯度较高的胎盘滋养层细胞。
（因成纤维细胞比上皮来的滋养层细胞先脱落，将先消化下的成纤维细胞弃掉，这样经过几次反复传代处理，可把成纤维细胞除净）。
用胰蛋白酶消化细胞要严格控制消化时间，此过程始终保持在倒置显微镜下观察，当滋养层细胞生长区域内有细胞发生细胞质回缩现象时终止消化。
弃掉消化液，在室温下静置1 min 左右，加入适量的培养液，用移液枪轻轻吹打成细胞
悬液，调整细胞密度为1X106个细胞/mL，按1：3 的比例进行传代培养。
3.3．细胞活力检测(台盼蓝排斥试验)
通过消化法分离组织，制备成单细胞悬液，做适当稀释（106/ml）)后取9滴细胞悬液移入小试管中，加1 滴0.4%台盼蓝溶液，混匀，镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，在 3 分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数，并计算细胞活率，重复 6 次取平均值。
根据下列公式计算细胞活力：
活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%
3.4．细胞冻存试验
(1)培养的细胞汇合达80%左右时,可进行细胞冻存,倾斜培养瓶,吸去陈旧培养基,37°C预热的PBS洗3次。
(2)使用37°C预热的浓度为0.25%胰蛋白酶,使液体覆盖整个瓶底面,尽快移至37 °C培养箱内,大部分细胞消化脱离瓶壁即可。
(3)使用等量的含有血清的高糖DMEM完全培养基,使胰蛋白酶停止消化作用,防止对细胞的过度消化,轻轻吹打使细胞,使细胞以单个形式
存在。
(4)移液器将消化得到细胞悬液,置于准备好的15 mL离心管,细胞保持混匀状态,微量移液器吸取少量细胞悬液进行细胞计数试验,其余细胞液体则用来进行细胞冻存。
(5)细胞悬液离心,1500 r/min,10 min,尽可能去除上清液体,保持细胞团块的完整性。
(6)现用现配细胞冻存液(DMEM:FBS : DMSO = 7: 2: 1),加入一定量
的细胞冻存液重新悬浮细胞,调整细胞密度。
(7) -80℃过夜保存,投入液氮,进行长期保存。
3.5．滋养层细胞的复苏试验
(1)把标记好的细胞冻存管,立即放入37℃的水浴锅内解冻,期间不停地温和摇动,使冻存液快速融化。
(2)冻存管使用75%的酒精消毒后,在超净台内,细胞悬液转入15 mL的离心管。
(3)再加入15 mL的高糖DMEM完全培养基,移液器轻轻吹打细胞悬液混合均匀,离心,1200 r/min,10 min,倒掉细胞上清液,剰余的是细胞团块。
(4)使用3 mL的高糖DMEM重新悬浮细胞,混合均匀,去少量的细胞做细胞计数。
(5)剩余的细胞则转到细胞培养瓶中,于37°C, 5% C02培养箱内培养。
(6)隔日除去未贴壁的细胞,更换新的培养基,以后每2d换一次液,观察细胞的生长状况和形态变化。