一株纤维素降解菌的筛选与鉴定
1株堆肥耐低温纤维素降解菌的筛选、鉴定及生长特性的初步研究
采 Ｏ℃ 的 温度 梯 度 进 行 本研究从 黑 龙江 双 峰林 场 采 集 的腐 殖 土 （ 境 培 养基 中 ， 取 ５℃ 一７℃ 一１ 环 驯 化培 养 ， 养周期 是 ３ｄ（ １ 。 个周 期后 ， ｌ 培 表 ）１ 取 ０ 温度 为 －２ ０℃） 中筛 选得 到 １株耐 低 温纤 维 素 降解 菌 ， 用形 态学 、 应 生理 生化特 征及 １ Ｓｒ ＮＡ 生物 学 ｍＬ的驯化 菌液 接种 到新鲜 的液体 培 养 基 中进 行 第 ６ Ｄ 周期 温 度梯度 的 驯化 培 养 ， 化 ３个周 期 ， 到 ３ 驯 得 手段 对其进 行鉴 定 ， 探讨 菌株 的生长 特性 ， 并 以期 为 ２
关键词
耐低温菌 ； 纤维素降解 ； 假单胞菌属 ；筛选 ； 生长特性
Ｑ ３３ ９—３ 文献标识码 Ａ 文章编号 １０ —４ １ ２ １ ）５０ ５—５ ０ ０２ ２ （０ ２ ０—５ ８０
中图 分 类 号
堆 肥技术 是一 种 使 废 弃物 无 害 化 、 量化 和 资 减
源 化 的关 键技 术 ， 中微 生 物 在堆 肥 过 程 中发 挥 着 其
２个供试 腐 殖 土 样 于 ２ １ ０ １年 ２月 在 黑 龙 江 双
２ 纤维 素 降解菌 的分 离 。分 别取 驯化 得 到的菌 ） 悬液 ０ ５ｍＩ， 入 到 ４ ５ｍＩ无 菌 水 中 ， ． 加 ． 以梯 度 稀
峰林 场采 集 ， 集 时的环境 温度 为 －２ 。 采 ０℃
１株 堆 肥 耐 低 温 纤 维 素 降 解 菌 的 筛 选 、 鉴 定 及 生 长 特 性 的 初 步 研 究
尚 晓瑛 程 旭艳 霍 培 书 李 季
中国农 业 大 学 资 源 与环 境 学 院 ， 京 １０ ９ 北 ０１３
降解纤维素菌株的筛选
纤维素降解菌的分离和筛选1.实验目的：1.掌握纤维素降解菌的的分离和筛选的方法2.学会会培养基的制备3.再次了解菌落的形态2.实验原理：从美术楼后面树林中取适量的土壤，用无菌水将得到的样品经适当稀释, 在37℃下培养1d后，稀释10-6、10-7、10-8三个浓度，分别接种于鉴别培养基中培养, 每组3个平行，在37℃下培养2-3 d，然后进行初筛，重复以上步骤，直至获得纯的菌株。
最后镜检。
3.试验方法：1. 取样先从树林中取10g土壤(10—15cm深)。
用灭菌的塑料袋盛装。
2．饥饿培养秤取10g土壤，置于250ml的装有90ml无菌水的锥形瓶中，摇匀，在37℃下培养1d。
3.梯度稀释所需仪器：试管（8支）、洗耳球、移液管。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、移液管。
用移液管从饥饿培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后用移液管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3, 10-4,10-5,10-610-7,10-8不同稀释度的土壤溶液。
4.选择培养○1刚果红培养基的制备所需要的仪器有：500ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、200ml培养基，用2层纱布加棉花做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层报纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
灭菌后，倒9个灭菌平板，凝固后待用。
○2涂布平板将上述已倒培养基的9个平板底面分别用记号笔写上10-6、10-7、10-8 3种稀释度（每个稀释度划3个平板）。
然后用移液管分别由10-6、10-7,10-8三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。
38℃倒置培养2-3d，至菌落长出，菌落周围将会出现透明圈。
○3菌落形态观察菌圈直径（0.3~0.6cm）○4划线分离PDA待凝固后，从以上涂布的9个平板当中取出1个菌落周围的透明圈比较大的平板。
一株纤维素高效分解性细菌的分离和筛选的开题报告
一株纤维素高效分解性细菌的分离和筛选的开题报
告
选题意义：
纤维素是植物细胞壁中最主要的成分，也是地球上最丰富的可再生
能源之一，其含量达到全球植被的40%以上。
但纤维素的高结晶度和难
降解性，使其无法被直接利用。
纤维素高效分解性细菌可以通过生物方
法将固体废弃物、能源作物等转化为生物质燃料和有机酸，具有被广泛
利用的潜力。
因此，本实验旨在筛选出纤维素高效分解性细菌，为纤维
素的利用提供理论基础和技术支持。
实验方法：
1. 样品的原料：从自然环境中采集土壤、水体等样品，用0.9% NaCl溶液过滤。
2. 样品的分离：分别取10μL、100μL等不同的样品，平板涂布在含有纤维素的LB琼脂平板上，并在30°C下孵育48-72小时。
3. 筛选纤维素分解性细菌：通过碘酸钾和怀尔德染色法筛选出纤维
素分解性细菌。
4. 纤维素水解酶产酶活呼吸速率测定：取纤维素分解性细菌培养物，分别在含有纤维素、葡萄糖和对照培养基中培养，同时进行产酶活和呼
吸速率的测定。
预期结果：
通过本实验可以得出纤维素高效分解性细菌的特点和产酶酶活呼吸
速率等重要性质，为纤维素的利用提供理论基础和技术支持，对环境保
护和资源利用具有重要意义。
一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果
ｃｎｉｏｓｏ ０ｒｒｎａ２ ｅｒｅ Ｃ ｈ ｅｐａ ａ ｅ ｏ ｄｇ ｃｎｓ Ｅ ／ ｅ ） ｅｏｌｃｎ ｅ（ Ｂ ／ ｅ ）ａｄＢ ｏｄｔ ｎ ｆ ２ ａ ８ｄｇ ｓ ．Ｔ ｅｋ ｌ ｓ ｆ ｎ ｏｌ ａａｅ（ Ｇ Ｃ ｎ ， ｘｇｕａａ Ｃ Ｈ Ｃ ｘ ｎ ． ｉ １ ／ｉ ｔ ｅ ｖｕ ｅ ｕ ｓ
基。 １ ）全国优 秀博 士学位论文专项 基金 （０５４ ； ２０４ ） 黑龙江 省杰出青
年基金 （Ｃ ０ ９ ９ 。 Ｊ ２０ ０ ） 第 一作者简介 ： 李保 深 ， ，９５年 ２月 生 ， 男 １８ 东北 林业 大学林 学 院， 硕士研究生 。 通信作 者 ： 高大文 ， 东北林 业大学林 学院 ， 授。Ｅ ｍ ｉ ｄｗｎ 教 — ａ ：ａｅ— ｌ
ｇ ｅ ｓ ａｅ（ ． ａｅ ｅ ． ５ ， ． ８ ｎ ． ８ ／ ｓ ｃ ｖ ｌ ｌ ｏｉ ｓ Ｂ Ｇ ｓ ）ｗ ｒ ３ ８ ６ ２ ６ １ａ ｄ １ ４ ７Ｉ ｍＬ ｒ ｐ ｔ ｅ ． ｙ ｄ ｅ Ｕ ｅｅ ｉ ｙ
Ｋｅ ｗｏ ｄ Ｓ ｒ ｅ ｅ ａ ａｉ ｎ ｙ ｒｓ ｃ ｎ ｓ ｐ ｔ ：Ｐｅ ｉｉ ｉｍ ｅ ｕ ｅ ｓ；１ Ｓ ｒ ｅ ｒ ｏ ｎ ｃｌ ｕ ｄ ｃ ｍｂ ｎ ｌ ８ ＤＮＡ；Ｃ ｌ ｌ ｅ；Ｓ ａ ｎ ｎ ｌｃ ｒｎ ｍｉ ｒｓ ｏ ｅ ｅｌ ａ ｕｓ ｃ ｎ ｉ ｇ ｅ ｅ ｔｏ ｃｏ ｃ ｐ ｓ
ｇｏ ｇ ｉ． ｏ ｏ ａ ＠ ｍａｌ ｅｍ
１ 材料 与方 法
收稿 日 ： １ 期 ２ ０年 ｌ ２ ０ ２月 ９日。 责任编辑 ： 红 。 程
１２ 分析方法 。 将纯培养菌株接人发 酵培 养基 中 ， ２ 、 ０ ／ ｉ 摇 床 ８℃ １ ｍｎ ２ｒ 培养 ７ｄ 用 移 液 枪 吸取 １ｍ ， Ｌ发 酵 液 离 心 （ ０ ／ ｉ ， ９０ ０ ｒｍ ｎ ５ ｍｉ） 上清液即为粗 酶液 。 ｎ， 酶活力 的测 定 ： 滤 纸糖 化力 的测 定 。取粗 酶 液 ０ ５ ① ． ｍ ， Ｌ加入醋酸一醋 酸钠 缓冲液 （Ｈ 值 ４８０ １ ｏ Ｌ ２ｍ ， ｐ ． ，． ｍ ｌ ） Ｌ ／ 然后 加入一张（ ｘ ） １ ｍ ６ ｍ 新华 １ ｃ ｃ 号滤纸 ， ℃恒 温水浴 １ ５ ０ ｈ
一株纤维素降解菌的筛选与鉴定
纤 维 素是 自然 界 中储 存量 最 大 、 布最 广泛 的 可 再 生 分 天 然 碳水 化 合 物ｉ 其 主 要存 在 于秸 秆 、 １ １ ， 木材 等 高等 植 物 的
细 胞 壁 中 ． 年 通过 光 合 作 用可 生 产纤 维 素 逾 ｌ 每 ０亿 ｔ 。 翻 然
条件 ：５℃预 变 性 ５ｍ ｎ ９ ９ ｉ ，４℃变 性 １ ｎ，６℃退 火 １ｍ ｎ， ｍｉ ５ ｉ ７ ２℃延 伸 １５ｍｉ ３ ． ｎ，５个 循 环 ，扩 增 结 束 后 ７ ２℃延 伸 ｌ ０ ｍｎ ｉ 。扩 增后 的 Ｐ Ｒ产物 用 １ Ｃ ％琼 脂糖 凝 胶 电泳 （０ １０Ｖ，０ ３
ｂ ｃｅ ａ（ ０） ａ ｅｅ ｔｄ ｆｏ ｔ ｅ ｅ ｈ ｐｉ ｌ ｃ ｌ ｒ ｏ ｄ ｔ ｎ ｈ ａ ｔｒ ｒ ｓ ｆｌ ｗ ｔｏ ｈ ｕｔ ｒ ｄ ｕ ｃ ｎａｎ ｎ ａ ｔｒ Ｘ１ ｗ ｓ ｓ ｌｃｅ ｒｍ ｌ ｓ ．Ｔ ｅ ｏ ｔ ｉ ｌ ｍａ ｕｔ ｅ ｃ ｎ ｉ ｓ ｏ ｔ ｅ ｂ ｃｅ ａ ｗｅｅ ａ ｏｌ ｓ：ｏ ｋ ｔ ｅ ｃ ｌ ｅ ｍｅ ｉｍ ｏ ｔｉ ｉｇ ｕ ｉ ｏ ｆ ｉ ｏ ｕ
ｃ ｌ ｌｓ － ｅ ａ ｉ ｇｅ ｚ ｍｅａ ｔ ｉ ａ ｐｔ ７４ Ｔ ｒｕ ｈ ｉ ６ ＲＮ ｅ ｕ ｎ ｉｇ ｔ ｅｈ ｍｏｏ ｙｏ ａ ｔｒ ｎ ｃ ｏ ａ ｔｒ ｍ ｘ ｄ ｎ ｒ ｅｌ ｏ ｅ ｄ ｇ ｄ ｎ ｎ ｙ ｃ ｖｔ Ｗ ｕ ６ ． Ｕ．ｈ ｏ ｇ ｓ１ ｓ ｕ ｒ ｉ ｙ ｓ ｏ ４ ｔ ｒ Ａ ｓ ｑ ｅ ｃｎ ， ｏ ｌｇ ｆ ｃｅ ａａ ｄＭｉｒｂ ｃｅ ｉ ｏ ｙ ａ ｓｗｅｅ ｈ ｂ ｉ ｕ ９ ％． ｈ ｅｅ ｔ ｎ ｏ ｌ ｏ ｅ ｄ ｇ ａ ｉ ｇｂ ｃｅ ａｐｏ ｉｅ ｅ ｕ ｃ ｃｅ ａ ｏ ｅｅ ｃｅ ｔ ｒ ｄ ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ９ Ｔ ｅｓｌｃ ｏ ｃ ｌ ｓ — ｅ ｄ ｎ ａ ｔｒ ｒｖｄ ｄ ａ ｗ ｓ ｒｅｏ ｂ ｔｒ ｒ ｈ ｆ ｉｎ ｏ ｕ ｔ ｎ ｏ ｃ ｌ ａ ． ｉ ｆ ｅｕ ｌ ｒ ｉ ｎ ｏ ｆ ａ ｉ ｆ ｔ ｉ ｐ ｉ ｆ ｅ ｕｓ Ｋｅ ｒ ｓ ｃ ｌ ｌｓ ｅ ｒ ｄ ｏ ａ ｔｒａ ｓ ｒ ｅ ｉｇ ｉｅ ｆ ｃ ｏ ｅ ｚ ｍｅａ ｔ ｉ ｙｗｏ ｄ ｅ ｕｏ ｅｄ ｇａ ￣ｉｎｂ ｃｅ ；ｃｅ ｎ ｎ ； ｎ ｆ ｍｉｎ；ｎ ｙ ｃｉ ｔ ｉ ｄ ｉ ｉ ｖｙ
纤维素降解微生物的分离与鉴定方法解析
纤维素降解微生物的分离与鉴定方法解析纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，它是一种由大量葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖。
纤维素的降解对于生物能源开发、废弃物处理和环境保护具有重要意义。
而纤维素降解微生物则扮演着关键的角色。
因此，分离和鉴定纤维素降解微生物的方法显得尤为重要。
本文将介绍几种常用的纤维素降解微生物的分离与鉴定方法。
一、平板法平板法是最为常用的纤维素降解微生物分离方法之一。
具体操作如下：1. 准备培养基：将适合纤维素降解微生物生长的培养基高温固化。
常用的培养基包括CMC培养基和Avicel培养基。
2. 稀释样品：将待分离的纤维素降解微生物样品进行适当稀释，通常采用百倍至千倍的稀释倍数。
3. 倒平板：将稀释后的样品均匀倒在高温固化的培养基上，并利用均衡板将其平均分布。
4. 培养：将平板培养在适当的温度下，一般为30-37℃，孵育时间根据需要而定。
5. 分离：观察培养基上的菌落情况，挑取个别菌落进行分离纯化。
二、液体培养法液体培养法是另一种常用的纤维素降解微生物分离方法。
主要包括以下步骤：1. 准备液体培养基：选取适合纤维素降解微生物生长的液体培养基，如液体CMC培养基、液体Avicel培养基等。
2. 接种：将待分离的纤维素降解微生物样品接种到含有相关培养基的试管中。
3. 培养：将试管放置于摇床或恒温培养箱中，在适当的温度和转速条件下培养一定时间。
4. 分离: 通过稀释方法，将培养液中的微生物进行分离纯化，得到单菌株。
三、生理生化特性分析对于分离的纤维素降解微生物，进一步进行鉴定需要进行生理生化特性分析。
常见的特性分析包括以下内容：1. 糖类利用能力：在各种糖类培养基上观察微生物的菌落形态和生长情况。
2. pH和温度适应性：分析微生物在不同pH和温度条件下的生长状况。
3. 酶活性检测：测定微生物产酶的能力，如纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等。
4. 生理代谢产物分析：通过气相色谱-质谱联用技术或其他适当的方法，分析微生物在纤维素降解过程中产生的代谢产物。
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化一、绪论纤维素是一种在自然界中广泛存在的多糖化合物，是植物细胞壁的主要成分之一，包括木质素、纤维素和半纤维素。
据统计，全球每年约有数十亿吨的植物纤维素被合成，其中约有90%的植物纤维素来自于农田作物秸秆、果壳、木材废弃物等。
纤维素具有很高的结晶性和高聚合度，使其难以被微生物降解。
但纤维素又具有广泛的应用价值，例如可用于生物燃料的生产、食品添加剂和医药领域等。
寻找能高效降解纤维素的微生物，对于资源循环利用、环境保护和生物技术的发展具有重要意义。
在农田中，菜地土壤是农作物生长的主要土壤类型之一，其中的微生物种类繁多。
其中一些具有降解各种有机物的潜能。
菜地土壤中的微生物资源对于寻找具有纤维素降解能力的菌株具有重要价值。
本研究旨在从菜地土壤中筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株，并对其产酶条件进行优化，以期能为纤维素资源的有效利用提供科学依据。
二、材料与方法1. 样品的采集本研究选取了5个不同类型的菜地土壤样品作为研究对象，分别是A、B、C、D、E五个样点。
每个样点的土壤样品采集3份，混合后称为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3、E1、E2、E3。
2. 纤维素降解菌的筛选将每份土壤样品分别加入无菌水中，制成不同浓度的土壤悬浊液。
接种于含有纤维素的琼脂板，培养48小时后进行细菌筛选。
通过观察产酶圈直径大小进行初步筛选，然后进行传代培养，最终选取具有较高产酶能力的菌株。
3. 菌株的鉴定通过形态学观察、生理生化实验以及16S rDNA序列分析等方法对菌株进行鉴定和分类。
4. 产纤维素酶条件的优化选取具有较高产酶能力的菌株，通过单因素试验和响应面试验确定最佳的产酶条件，包括温度、pH值、碳源和氮源的种类和浓度。
5. 酶活力测定采用标准方法测定优化条件下菌株产酶的酶活力，并进一步评估其降解纤维素的能力。
三、结果与讨论经过初步筛选和传代培养，从15个菜地土壤样品中筛选出了10株具有较高纤维素酶产酶能力的菌株。
纤维素降解细菌的筛选及酶活测定
纤维素降解细菌的筛选及酶活测定1 材料与方法1．1 含菌样品含菌样品取自校园里的腐烂树叶处的土壤。
1．2 培养基(1)CMC(羧甲基纤维素)培养基：CMC-Na15 g， NH4NO3 1 g，MgSO4 ·7H20 0．5 g，KH2PO4 0.5 g，琼脂2％，H201 000 mL，pH 自然，121 ℃灭菌。
(2)刚果红鉴定培养基：KH2PO4 0.2％，MgSO4 0．05％，(NH )2SO40．1％，琼脂2％，刚果红0．02％，CMC—Na 2％，NaC1 0．05％，pH自然。
(3)液体产酶培养基：CMC—Na 15 g，NH4 NO31 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0．5 g，H20 1000 mL,初始pH值霉菌调为5，细菌调为8 1.3 菌株的筛选初筛采用滤纸条崩解实验及刚果红平板识别，复筛采用液态产酶鉴定。
1.4 CMC酶活力的测定1.4.1 DNS法绘制标准曲线采用3，5一二硝基水杨酸比色定糖法(DNS) 测定酶解液中还原糖含量。
取9支比色管，分别按表顺序加入各种试剂，将各管溶液混匀，用空白管溶液调零，测520 nm处的光密度值，绘制标准曲线1.4.2 测酶活将菌株接种于发酵培养基，30℃，l80 rpm培养4 d，从培养基中取l ml菌液放人试管，加水稀释至5 ml，4000 rpm离心5 min。
移取上清液 0．5 ml于试管中，加入含 0．5％ CMC—Na的柠檬酸缓冲液(0．05 mol／L，pH 4．4)1．5 ml，50℃水浴锅准确作用30 min，在每试管内加 1.5 ml DNS试剂，沸水浴 5 min，立即冷却，520 nm处测定其OD值，对比标准曲线，求葡萄糖含量。
酶活力计算公式：酶活力=葡萄糖量×10(10一稀释倍数)酶活力单位(u)=(1 mg葡萄糖／m1)·30 min。
2.流程分析(1)纤维素降解菌的筛选：将含菌样品富集培养后，取菌液0．1 mL 涂布于羧甲基纤维素平板中，待其长出菌落后，进行平皿划线法分离，分离到一系列纤维素降解菌。
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Screening and Identification of Cellulose Degradation Bacteria LI Yan-hong
（College of Life Science，Southwest University，Chongqing 400715） Abstract 12 cellulose-degrading bacterias were enriched and isolated from the leaves of the humus layer covering the soil and a high-degrading bacteria （ X10 ） was selected from these. The optimal culture conditions of the bacteria were as follows ： took the culture medium containing glucose+micrite cellulose （1∶1）as carbon sources，peptone+beef （1∶1）as nitrogen sources，pH 7.5，under 30 ℃ ，with the culture time was 40 h，the cellulose-degrading enzyme activity was up to 67.44 U.Through its 16s rRNA sequencing，the homology of bacteria and Microbacterium oxydans were 99%.The selection of cellulose-degrading bacteria provided a new source of bacteria for the efficient production of cellulase. Key words cellulose degradation bacteria；screening；identification；enzyme activity
农业基础科学
现代农业科技 2012 年第 2 期
一株纤维素降解菌的筛选与鉴定
李Байду номын сангаас红
（西南大学生命科学学院，重庆 400715）
摘要 从落叶覆盖的腐殖层土壤中富集、分离得到 12 株纤维素降解菌，从中筛选出一株高效降解菌 （X10），研究其最适宜的培养条件 为：配制以葡萄糖+微晶纤维素（1∶1）为碳源、以蛋白胨+牛肉膏（1∶1）为氮源的培养基 ，pH 值 7.5，30 ℃下 培养 40 h，测 得纤 维素 降 解酶 酶活 可达到 67.44 U。通过对其 16s rRNA 测序鉴定，该菌与氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）有 99%的同源性。纤维素降解菌的选育可为高效 生产纤维素酶提供新的菌种来源。
纤维素是自然界中储存量最大、分布最广泛的可再生 天 然 碳 水 化 合 物[1]，其 主 要 存 在 于 秸 秆 、木 材 等 高 等 植 物 的 细 胞 壁 中 ，每 年 通 过 光 合 作 用 可 生 产 纤 维 素 逾 10 亿 t[2]。然 而纤维素难以降解，导致其利用具有一定的局限性。目前， 降解纤维素最有效、最经济的方法是生物降解法，即通过细 菌、放线菌以及真菌等生物产生的纤维素酶来催化降解纤 维素。因此，寻找和驯化产生高效纤维素酶的微生物是有效 降解纤维素的前提条件。该研究从土壤中筛选降解纤维素 的菌株，并对其产酶条件进行研究，以为纤维素的降解和合 理利用提供一定的资源。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 样品 来 源 。样 品 取 自 重 庆 市 缙 云 山 落 叶 覆 盖 的 腐 殖 层土壤。 1.1.2 培 养 基 。LB 培 养 基 、刚 果 红 培 养 基 [3]、羧 甲 基 纤 维 素 培 养 基[4]。 1.2 试验方法 1.2.1 纤维 素 降 解 菌 的 初 筛 和 纯 化 。纤 维 素 降 解 菌 的 初 筛 和 纯 化 按 照 卢 月 霞 等 [5]的 方 法 进 行 。 1.2.2 纤维 素 降 解 菌 的 复 筛 。分 别 将 纯 化 后 的 单 菌 落 点 样 于刚果红培养基中，每个平板点 1 个菌种，且只点 3 个样， 降 解 圈 直 径 （D）与 菌 落 直 径 （d） 比 值 的 大 小 可 以 直 接 反 应 纤 维 素 酶 活 的 相 对 大 小[6]。因 此 ，筛 选 降 解 圈 直 径 与 菌 落 直 径 比 值 最 大 的 菌 落，即 为 纤 维 素 高 效 降 解 菌 ，用 CMC 培 养 基 作斜面培养，4 ℃保存。 1.2.3 16s rRNA 测序。使用小量细菌基因组 DNA 抽提试剂 盒 对 纤 维 素 降解 菌 进 行 基 因 DNA 提 取 ，以 此 为 模 板 ，以 通 用引物 8F 和 1495R 进行 PCR 扩增 16s rRNA。PCR 体系为 ： D.W 14.5μL，Buffer（Mg2+free）2.5 μL，Mg2+1.5 μL，dNTP 2 μL， 上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，模板 2 μL，Taq 酶 2 U。反 应
收稿日期 2011-11-28
34
条件 ：95 ℃预 变 性 5 min，94 ℃变 性 1 min，56 ℃退 火 1 min， 72 ℃ 延 伸 1.5 min，35 个 循 环 ， 扩 增 结 束 后 72 ℃ 延 伸 10 min。 扩增后的 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳 （100 V，30 min）进行分析，将在 1 000～2 000 bp 出现较亮条带的样品送 去宝生物公司进行测序。 1.2.4 纤维素酶酶活的测定。按照李慧 君 等[7]的 方 法 进 行 粗 酶的提取，同时通过 DNS 显色检测酶活，葡萄糖标准曲线的 绘制以及酶活 的 检 测 具 体操 作 参 照 GB 20287-2006[8]。酶 活 力单位（U）：1 mL 原样酶液，1 min 产生 1 μg 葡 萄 糖 定 义为 1 个酶活力单位。 1.2.5 降解菌培养条件的优化 。研究不用培养温度 、pH 值、 碳源、氮源对其产酶的影响，并在各因子最适条件下培养该 菌，检测其产酶酶活。 2 结果与分析 2.1 纤维素降解菌的筛选与纯化