双水相萃取

同一聚合物的疏水性随分子量的增
大而增大，当PEG的分子量增加时， 在质量浓度不变的情况下，其两端羟 基数减少，疏水性增加，亲水性的蛋 白质不再向富含PEG相中聚集，而转 向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易 分配于富含PEG的相了
(2)高聚物浓度——界面张力的影 响
当成相系统的总浓度增大时， 系统远离临界点，系线长度增加， 两相性质的差别(疏水性等)增大， 界面张力也随着增大，蛋白质分子 的分配系数将偏离临界点处的值 (m=1)，即大于1或小于1。
• (2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够 在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高 产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按 比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续 生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受 到限制。 • (3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类 和浓度、 pH 以及温度等均能影响被分配物质 在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进 而达到目的产物的最佳萃取条件。 • (4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加 入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然 后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间， 又避免了胞内酶的损失。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物
葡聚糖 聚乙二醇 非离子型聚合物/ 非离子型聚合 物 聚乙烯醇 聚乙二醇
聚丙二醇
聚乙烯吡咯烷酮 高分子电解质/非离子型聚合物 高分子电解质/高分子电解质 聚合物/ 低分子量化合物 羧甲基纤维素钠 葡聚糖硫酸钠 葡聚糖 聚乙二醇 羧甲基纤维素钠 丙醇 磷酸钾 聚合物/ 无机盐 聚乙二醇
• 双水相萃般与水-有机相萃取的原理相似， 都是依据物质在两相间的选择性分配， 但萃取体系的性质不同。 当物质进入双 水相体系后，由于表面性质、电荷作用 和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的 存在和环境因素的影响，在上相和下相 间进行选择性分配，这种分配关系与常 规的萃取分配关系相比，表现出更大或 更小的分配系数。
双水相系统的相图可由实验测定： 将一定量的高聚物P浓溶液置于试 管内，然后用已知浓度的高聚物溶液 Q来滴定。 • 随着高聚物Q的加入，试管内溶液 由均相突然变混浊，记录Q的加量。 然后再在试管内加入l ml水，溶液又 澄清，继续滴加高聚物Q，溶液又变 混浊，计算此时系统的总组成。
•
3.4 双水相萃取的基本原理
• 1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系 用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使 胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于 双水相体系的研究和应用逐步展开并取得 很大进展。现在双水相萃取已被广泛用于 蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器 等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业 化生产迈进，展现了在食品工业、生物学 研究和生物工程方面的巨大应用前景。
• (5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双 水相体系中可将发酵生产过程中的生物 转化与下游处理的第1步相结合，即生物 反应在其中一相中进行，同时生成的反 应产物被连续萃取到另一相中。不仅解 决了产物反馈抑制作用造成的产量低的 问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲 液中更稳定，活性更大。因为生物反应 和生物产物的提取同时进行，尤其适于 连续生产。
（二）发展历史
• 1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂 和可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个 混不透明的溶液，随之分为两相，上相富 含明胶，下相富含琼脂（或淀粉），从而 产生了双水相体系。 • 1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新 发现此体系并第一次用来提取生物物质。
发展历史
作用力为斥力：形成两个水相，两种高 聚物分别富集于上、下两相。 作用力为引力：也形成两个水相，但两 种高聚物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互 溶，形成均相的高聚物水溶液 高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物 的不相容性 高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这 是由于盐析作用。
•
由于高聚物对生物活性物质有稳 定作用，在大规模生产中多采用常 温操作，从而节省冷冻费用。但适 当提高操作温度，体系黏度较低， 有利于分离。
3.6 双水相萃取的特点
双水相萃取对于生物物质的分离 和纯化表现出特有的优点和独有的 技术优势，具体表现在以下方面： • 1 易于放大。各种参数可以按比 例放大而产物收率并不降低。
（三）双水相的形成与相图
3.1概念
把两种或两种以上具有一定浓度的亲水性 聚合物溶液混合后静置，这些亲水性的高 分子聚合物并不混为一相，而是分成多个 液相，这种现象称之为聚合物的不相容性。
定义:
由于这些聚合物都是以水作为溶剂;因 此形成上述的两个相体系就称双水相体系。
利用双水相的成相现象及待分离组分 在两相间分配系数的差异，进行组分分离 或多水相提纯的技术就叫做双水相萃取技 术。
(3) 盐类
• 在双水相聚合物系统中，加入电解质， 首先阴阳离子会有不同的分配。
• 盐的正负离子在两相间的分配系数不同， 由于各相应保持电中性，因而在两相中形 成电位差，这对带电生物大分子的分配， 产生很大的影响。
在pH6.9时溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。当 加入NaCl时，其浓度低 于50mmol/L时可见上 相电位低于下相电位， 使溶菌酶分配在上相， 从而分配系数增大。 而卵蛋白的分配系数减 小。
• (6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和 萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的 理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和 萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的 配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合 物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃 取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的 那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入 另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激 酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等 粒子的提取。
硫酸铵
葡聚糖（Dextran） 与聚乙二醇 （PEG）按一定 比例与水混合，溶 液混浊，静置平衡 后，分成互不相溶 的两相，上相富含 PEG、下相富含 葡聚糖，见左图
3.2 双水相的形成
• 两种亲水性聚合物混合 1 混合熵的增加 2 分子间作用力 对大分子而言，由于相对分子质量较 大，分子间作用力与熵增加相比占主导地 位。
3.8 双水相萃取技术缺点：
• 易乳化、相分离时间长，成相聚合 物的成本较高，水溶性高聚物大多 数黏度较大，不易定量控制；水溶 性的高聚物难以挥发，使反萃必不 可少，高聚物回收困难等。
若A向双节线移 动，B、C两点接 近，系线长度趋 向于零时，即A 点在双节线K点 时，体系变成一 相，K称为临界 点。在同一系线 上不同的点，总 组成不同，而上、 下两相组成相同， 只是两相体积VT、 VB不同，但它们 均服从杠杆原理。
• B相和C相质量之比等于系线上CA 与AB的线段长度之比。又由于两 相密度相差很小(双水相体系上相 和下相密度常在1.0～1.1kg／dm3 之间)，故上下相体积之比也近似 等于系线上CA与AB线段长度之比， 即：
第一，pH值会影响蛋白质分子所带电荷的性 质和数量。 第二，pH值影响磷酸盐的离解程度，从而改 变H2PO4-和HPO42- 之间的比例，进而影响 相间电位差。这样蛋白质的分配因pH值的 变化发生变化。pH值的微小变化会使蛋白 温度
温度影响双水相系统的相图， 从而影响蛋白质的分配系数。温度 越高发生相分离所需的高聚物浓度 越高。在临界点附近对双水相体系 形成的影响更为明显。但一般来说， 当双水相系统离双节线足够远时， 1～2℃的温度改变不影响目标产物 的萃取分离。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
研究还发现，当盐类浓度增加到 一定程度，由于盐析作用蛋白质易 分配于上相。分配系数几乎随盐浓 度成指数增加，且不同的蛋白质增 大程度各异。利用此性质可使蛋白 质相互分离。KCl对分配的影响与 NacI类似。
(4) pH值
pH值对分配的影响源于两个方面的原因。
• 2 双水相系统之间的传质和平衡过 程速度快，回收效率高，能耗较小， 速度快。如选择适当体系，同收率 可达80％以上，提纯倍数可达2～ 20倍。 • 3 易于进行连续化操作，设备简 单，且可直接与后续提纯工序相连 接，无需进行特殊处理。
4 双水相体系的相间表面张力大 大低于有机溶剂与水相之间的相间 张力，相分离条件温和，因而会保 持绝大部分生物分子的活性，可直 接用在发酵液中。
双水相萃取技术
（Two-aqueous phase extraction）
目录
• • • • • • 一 背景 二 发展历史 三 双水相的形成与相图 四 双水相萃取的工艺流程 五 应用 六 发展方向
（一）背景
• 现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往 往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化， 细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同 时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强 度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中 的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法 并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生 反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的 分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要 开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效 的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(又称水溶 液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、极有 前途的新型分离技术。
• 5 影响双水相体系的因素比较复杂，可以 采取多种手段来提高选择性或提高收率。 • 6 操作条件温和，整个操作过程在常温常 压下进行。 • 7 不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般 是不挥发性物质，因而操作环境对人体无 害。
• 8 亲和双水相萃取技术可以提高分配系数 和萃取的专一性。
3.7 双水相萃取的优点
•
适宜的工艺条件主要通过实验 方法得到。 • 这些因素直接影响被分配物质 在两相的界面特性和电位差，并 间接影响物质在两相的分配。通 过选择合适的萃取条件，可以提 高生物物质的收率和纯度，也可 以通过改变条件将生物物质从双 水相体系中反萃出来。