反硝化聚磷菌菌种筛分与除磷特性分析

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反硝化聚磷菌的脱氮除磷机制及其在废水处理中的应用

反硝化聚磷菌的脱氮除磷机制及其在废水处理中的应用反硝化聚磷菌的脱氮除磷机制及其在废水处理中的应用随着工业发展和人口增长，废水排放问题日益凸显。

氮和磷是废水中的主要污染物之一，对水生态环境造成了严重影响。

因此，研究高效的废水处理技术显得尤为重要。

反硝化聚磷菌作为一种新型微生物，其脱氮除磷机制在废水处理中发挥了重要作用。

一、反硝化聚磷菌的简介反硝化聚磷菌是属于异养微生物的一类。

它们在缺氧条件下能够同时完成硝化和反硝化过程，将废水中的氨氮转化为N2气释放至大气中。

此外，反硝化聚磷菌还具有优良的除磷能力，能够将废水中溶解性磷转化为固定态磷，从而实现废水中氮磷的联合去除。

二、反硝化聚磷菌的脱氮除磷机制反硝化聚磷菌的脱氮除磷机制包含两个主要过程：硝化和反硝化。

首先，在含氧充足的条件下，反硝化聚磷菌能够将废水中的氨氮通过硝化作用转化为硝态氮。

其次，在缺氧条件下，反硝化聚磷菌通过反硝化过程将硝态氮还原为氮气，从而实现脱氮。

同时，反硝化过程还能释放出大量的自由电子和H+，为菌体的生长提供所需的能量。

此外，反硝化聚磷菌的菌体表面还有特殊的结构，能够吸附和吸引磷酸根离子，实现除磷作用。

三、反硝化聚磷菌在废水处理中的应用由于反硝化聚磷菌具有同时完成脱氮和除磷的能力，因此在废水处理中有着广泛的应用前景。

固定化技术是将反硝化聚磷菌生物膜固定在滤料或载体上，形成固定化生物膜反应器进行废水处理的一种方法。

通过固定化反硝化聚磷菌，可以有效地提高废水处理的效率和稳定性。

相比于传统的生物处理方法，固定化反硝化聚磷菌具有更高的去除率、更短的处理时间和更小的设备占地面积。

此外，反硝化聚磷菌在新型废水处理技术中还有着重要的应用。

比如，反硝化聚磷菌与厌氧氨氧化菌（Anammox）联合运用能够实现废水中氮磷的高效去除。

同时，反硝化聚磷菌还可以与微生物燃料电池结合，利用菌体产生的电子来发电。

这些创新性的技术为废水处理行业带来了更多的应用选择和发展机遇。

重点一株反硝化聚磷细菌的分离及鉴定

Ｂａｎｋ数据库中比对表明，菌株ＲＣｌｌ与已报道的荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＲＲ２－６—９
（ＡＪ８５１２０４）序列相似性为９９％，推断该菌为荧光假单胞菌。通过ＣｌｕｓｌａｌＸ和ＢｉｏＥｄｉｔ等软件进行多重序列比对分析，并以Ｎｅｉｇｈｂｏｒ＿ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统发育树，确定其进化地位，结果见图１。
无衰2分离菌株生理生化特征反应底物结果反应底物结果鸟氨酸脱羧酶一阻葡萄糖苷酶一精氨酸双水解酶甘露醇一赖鲺酸脱羧酶一麦芽精一脲酶一侧金盏花酶一l阿拉伯糖醇一n一乙酰一b葡萄糖苷酶一半乳糖酸盐一吲哚产生一5一酮基一葡萄糖酸钠硝酸盐还原到亚硝酸盐脂肪酶纤维二糖海藻糖一昏半乳糖苷酶一d阿拉伯糖醇一葡萄糖一蔗糖一氧化酶一l阿拉伯糖一反硝化产气一葡萄糖酸酶一a葡萄糖山梨醇一a半乳糖苷酶一a麦芽糖苷酶一l天门东苏芳胺酶一2416srdna测序及系统发育分析经测序后获得片段长度为917bp在genebank数据库中比对表明菌株rcll与已报道的荧光假单胞菌pseudomonasfluorescensrr269aj851204序列相似性为99推断该菌为荧光假单胞菌
ＰＣＲ反应体系（５０弘１）：１０×ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍ９２＋）５弘ｌ，ｄＮＴＰｓ４肛ｌ，正向和反向引物各１弘１，模板１肛ｌ，Ｔａｑ聚合酶缓冲液１ｐｌ，重蒸水３７肛ｌ。
ＰＣＲ程序：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，循环３０次；７２℃１５ｍｉｎ。测序由上海生工生物工程有限公司完成。１．８．２系统发育分析
用无菌移液管取池塘底泥２５ｍｌ，置于带有磁力搅拌子的无菌带塞锥形瓶中，再加入０．８％无菌生理盐水２５ｍｌ，在磁力搅拌器上振荡３０ｍｉｎ，打散菌胶团，制成菌悬液。１．５．２菌株富集培养

反硝化聚磷菌生物特性的研究

（１．黑龙江工程学院土木与建筑工程学院，黑龙江哈尔滨１５００５０；２．黑龙江大学，黑龙江哈尔滨１５００８０；３．哈尔滨供排水
集团，黑龙江哈尔滨１５００４０；４．黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江哈尔滨１５００２８）
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨｖａｌｕｅａｎｄｇｒｏｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏｖａｌｅｆｆｅｃｔｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｍｏｖａｌｂａｃｔｅｒｉａ，ｔｈｉｓｐａｐｅｒｐｒｏｖｉｄｅｓｔｈｅｎｅｗｉｄｅａｓ
第３Ｏ卷第６期
２０１６年１２月
黑
龙
江
工
程
学
院
学
报
ＶｏＬ３０．Ｎｏ．６
Ｄｅｅ．，２０１６
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｒ）【）Ｉ：１０．１９３５２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ１６７１ — ４６７９．２０１６．０６．００９

反硝化聚磷菌培养驯化分离方法及菌种特性的研究的开题报告

反硝化聚磷菌培养驯化分离方法及菌种特性的研究的开题
报告
一、研究背景
反硝化聚磷菌是一类重要的微生物资源，能够在低氧环境下利用硝酸盐等氧气供体进行反硝化过程，并且还能够利用无机磷酸盐合成多聚磷酸盐。

多聚磷酸盐是生物体内最重要的无机磷存储形式之一，对于维持生态系统的稳定性和生物循环具有重要的生态学和微生物学意义。

然而，由于反硝化聚磷菌数量较少、分布范围广、分离困难等因素，反硝化聚磷菌的研究受到了很大的限制。

因此，开展反硝化聚磷菌的培养驯化分离研究具有重要的理论和应用价值。

二、研究内容及方法
本研究计划采取以下方法开展反硝化聚磷菌的培养驯化分离及菌种特性研究：
1.采集不同环境样品，如沉积物、底泥等，建立样品库。

2.采用适当的营养基，如混合碳源、氮源、硫源等营养基，培养反硝化聚磷菌。

利用微生物毒性试验等方法筛选出适宜反硝化聚磷菌生长的培养条件。

3.筛选培养出的反硝化聚磷菌，根据形态和生理特性确定其分类和物种。

4.对分离得到的反硝化聚磷菌的多聚磷酸盐合成能力进行实验室研究。

通过测定多聚磷酸盐合成速率、酶活力等参数，分析不同反硝化聚磷菌合成多聚磷酸盐的差异及影响因素。

5.利用PCR技术对分离得到的反硝化聚磷菌的多聚磷酸盐合成相关基因进行克隆和测序，分析多聚磷酸盐合成途径的分子机制。

三、研究意义
本研究的开展将深入探究反硝化聚磷菌的生态学和微生物学特性，对于完善反硝化过程的基础理论和促进生态环境保护具有重要的理论和应用价值。

同时，本研究也可为反硝化聚磷菌资源的开发利用提供技术支持和理论指导。

高效反硝化聚磷菌株的筛选及其生物学特性

Ｃａｉｔｒａｓｓｗｅｅｓｒｅｅｈｏｐｈｔｔｋｅｅｐｅｉｅｔ，ｗｈｅｅｎｉｒｔｓｗｅｅｄｎｔｉｉｄｔｎｄｄａｅｏｇｎｉｍｒｃｅｎｄｂｙａｐｓａｅｕｐａｘｒｍｎｒｔａｅｒｅｉｒｆｅｏ
维普资讯
第２卷第６８期
２００７年６月
哈
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程
大
学
学
报
ＶｏｎＥｎｉｅｒｎｉｅｓｔｏｒａｒｉｇｎｅｉｇＵｎｖｒｉｙｏ
１５０００１）
摘要：为研究反硝化聚磷菌的生物学特性，过吸磷试验、酸盐还原产气试验及异染颗粒和Ｐ通硝ＨＢ颗粒染色辅助
检验，稳定运行的厌氧／从缺氧ＳＲ反应器中分离筛选出４株高效反硝化聚磷菌Ｈ１、９Ｈ２Ｂ６Ｈ１、４和Ｘ．ｇ经鉴定，３前
ＣｖｌＥｎｉｅｒｎＨａｂｎＥｎｉｅｒｎｉｅｓｔＨａｂｎ１００，ｉａｉｉｇｎｅｉｇ，ｒｉｇｎｅｉｇＵｎｖｒｉｙ，ｒｉ５０１Ｃｈｎ）
ＡｂｔａｔＴｏｔｙｔｏｏｃｌｈａａｔｒｓｉｓｏｄｎｔｉｙｎｇｈｏｐｔ — ｃｕｍｕｌｔｎｇｏｇｎｓｓｒｃ：ｓｕｄｈｅｂｉｌｇｉａｃｒｃｅｉｔｃｆｅｉｒｆｉｐｓｈａｅａｃａｉｒａｉｍｓ（ＤＮ—
者属于假单胞菌属（ｓｕｏｏａ）后者属于肠杆菌属（．ｔｒｂｃｅ）测定了这４株菌的生长曲线，究了温度和Ｐｅｄｍｎｓ，Ｆｅｏａｔ．ｎｒ研

A2O工艺缺氧池中反硝化聚磷菌的比例、特性研究及菌株鉴定

Ｋ２４０ＨＰ
５
ＭＢ４ＯＳ
ＺＣＺｎＩＦＣ３ｅｉ
４５．级冲剂及微量元索０１．缓冲剂及微量元素
０５．缓冲剂及微量元素
图１厌权／缺级反应装１Ｆｇ１ｌｄｇａｆｔａａｒｂ／ｎｘｂｒｃｒｉＦｗｒｏｈｎｅｏｉａｏｉｉｅｔ．ｏｉｍｒａｅｃｃａｏｏ
同步反硝化聚磷特性实验，为改良传统的Ａ／２０工
艺，开发新的反硝化除磷工艺提供理论支持。
１材料与方法
１１试验设备．
（Ｐ）３ＫＢＤＢ１，Ａ等［７３Ｕ２８１从动力学性质上对ＰＯ７Ａ
和ＤＢ进行了比较，Ｐ认为以Ｎ３作为电子受体的０ＤＢ有着和ＰＯ同样高的强化生物除磷性能。这ＰＡ就使得聚磷和反硝化脱氮这两个互相独立的生物化学过程，借助同一种细菌在同一环境下同步完成，从
１２供试材料．１２１供试活性污泥．．取运行情况良好的广州大坦沙污水处理厂
份，其中一份瞬时投人２ｍ／５Ｌ的Ｎ３Ｎ作为电ｇ０－，－子受体，继续在厌氧／缺氧反应装置内进行缺氧反硝
化聚磷试验。另一份移人厌氧／好氧反应装置内曝气，０作为电子受体进行好氧聚磷试验。每隔一以２定时间取样，３ｒｍｎ置于００ｉ离心器进行泥与水分０／离１ｉ，定上清液中的ＣＤＰ３－ｍｎ后测Ｏ，－Ｐ和０Ｎ３整个试验过程跟踪监测ＯＰ通过加人稀０－Ｎ，Ｒ，
试验设备采用释磷／聚磷装置，即分别为厌氧／缺氧反应装置（采用Ｎ进行搅拌防止泥水分层并同时２保证实验的厌氧／缺氧环境条件）和厌氧／好氧反应装置（以粘砂块作为微孔曝气头采用鼓风曝气方式）如，

反硝化聚磷菌的筛选驯化及其脱氮除磷的效能研究

反硝化聚磷菌的筛选驯化及其脱氮除磷的效能研究摘要：反硝化聚磷菌是一类具有优异脱氮及除磷功能的微生物，本文以反硝化聚磷菌的筛选驯化及其脱氮除磷的效能研究为题，对反硝化聚磷菌的生理特性、筛选驯化、环境适应能力及其在脱氮除磷过程中的应用等方面进行了探讨和总结。

首先对常见的反硝化聚磷菌进行了分类和鉴定，介绍了其生长特性、代谢途径和代表菌的特点。

然后探讨了反硝化聚磷菌的筛选方法和驯化过程，阐述了物理、化学和基因工程等方法在反硝化聚磷菌筛选中的应用，并从优化培养基、控制生长条件等方面进行了菌株驯化的研究。

其次，针对反硝化聚磷菌在不同环境条件下的适应能力，探讨了其在环境因素变化下的适应性和增强适应性的机制，如微量元素的作用和自适应突变等方面。

最后，重点阐述了反硝化聚磷菌在脱氮除磷过程中的应用和效能，包括同步脱氮除磷工艺的研究、反硝化聚磷菌与其他微生物协同作用的研究等。

本文总结了反硝化聚磷菌在环境净化中具有潜在的应用前景，为其进一步开发利用提供了科学依据。

关键词：反硝化聚磷菌，筛选驯化，环境适应能力，脱氮除反硝化聚磷菌是一类可以同时完成污水处理中氮和磷的去除的微生物。

本文对反硝化聚磷菌的生理特性、筛选驯化、环境适应能力及其在脱氮除磷过程中的应用等方面进行了综述。

首先，本文分类和鉴定了常见的反硝化聚磷菌，并介绍了它们的生长特性、代谢途径和代表菌的特点。

接着，本文探讨了反硝化聚磷菌的筛选方法和驯化过程，包括物理、化学和基因工程等方法，并重点阐述了菌株驯化方面的研究。

此外，本文还对反硝化聚磷菌在不同环境条件下的适应能力进行了探讨，包括其在环境因素变化下的适应性和增强适应性的机制，例如微量元素的作用和自适应突变等方面。

最后，本文重点介绍了反硝化聚磷菌在脱氮除磷过程中的应用和效能，包括同步脱氮除磷工艺的研究、反硝化聚磷菌与其他微生物协同作用的研究等。

本文总结了反硝化聚磷菌在环境净化中具有潜在的应用前景，为其进一步开发利用提供了科学依据未来反硝化聚磷菌的应用前景非常广阔，特别是其在污水处理领域的应用。

反硝化聚磷菌富集、筛选及其特性

反硝化聚磷菌富集、筛选及其特性贾学斌;王强;杜丛;孙静文;姜欣欣;王春丽;马放【摘要】为进一步探讨反硝化除磷机理和提供脱氮除磷功能菌株,对A2SBR快速富集驯化并筛选其中反硝化聚磷菌功能菌.采用控制A2SBR进水及运行方式对反硝化聚磷菌进行快速富集筛选,并将所筛菌株进行复配研究,为构建脱氮除磷菌剂奠定基础.两段进水和提高注水比的运行方式能使反硝化聚磷菌在反应器中迅速成为优势菌.实验分离得到效果较好的反硝化聚磷菌,通过脂肪酸鉴定其到属.所筛菌株复配效果最好的是b204和16,吸磷率达85.78%,脱氮率为75.02%,相对于单菌株均表现出较好的脱氮除磷效果.采用两段进水和高注水比运行方式对快速富集反硝化聚磷菌较为有效,适当复配方案对提高处理效果有一定效果,b204和菌16组合可以作为潜在脱氮除磷菌剂生物强化菌剂.【期刊名称】《哈尔滨工业大学学报》【年(卷),期】2011(043)002【总页数】5页(P35-39)【关键词】生物除磷;富集;聚磷菌;反硝化聚磷菌【作者】贾学斌;王强;杜丛;孙静文;姜欣欣;王春丽;马放【作者单位】哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,150090,哈尔滨;黑龙江大学,建筑工程学院,150080,哈尔滨;哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,150090,哈尔滨;哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,150090,哈尔滨;哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,150090,哈尔滨;哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,150090,哈尔滨;哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,150090,哈尔滨;哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,150090,哈尔滨【正文语种】中文【中图分类】TU992随着我国废水排放总量的日益增加，由氮磷污染物引发的水华、赤潮已经对饮用水安全造成极大危害，因此如何有效的去除水体中氮、磷，防止水体富营养化已成为我国最主要水污染防治问题之一.反硝化除磷工艺由于集反硝化过程与除磷过程为一体而成为废水生物处理技术领域的研究热点.反硝化除磷工艺中功能菌群是反硝化聚磷菌，由其在缺氧条件下实现了同步脱氮和除磷的目的［1］.一些学者曾经认为脱氮过程中产生的硝酸盐和亚硝酸盐可能抑制除磷过程［2-3］，但Kuba(1994)［4］发现反硝化除磷菌的除磷能力与普通除磷菌相似，还能利用NO3-作为电子受体氧化细胞内储存的PHB，从而去除废水中氮素，在除磷同时进行反硝化，简化了脱氮除磷工艺. Hu J Y［5］等人也发现亚硝态氮在较低的质量浓度条件下，可以和氧气、硝态氮一样成为供除磷菌选择的电子受体.近年来，国内外学者相继对反硝化聚磷菌的种属组成进行了研究，由于DPB是兼性厌氧菌，培养条件相对复杂、操作困难且培养时间长［6］，筛选工作量大且效率低的原因，反硝化聚磷菌纯培养物研究较少，目前获得反硝化聚磷菌纯菌鲜见报道［7］.因此如何充分利用DPB优越性提高生物脱氮除磷工艺的处理效率，首要解决的问题是反硝化聚磷菌的分离以及筛选，反硝化聚磷菌纯菌的研究具有十分重要的意义［8］.本文利用控制A2SBR进水及运行方式驯化普通活性污泥，实现了反硝化聚磷菌的快速富集，并从自控SBR脱氮除磷系统分离得典型的反硝化聚磷菌，考察了所筛菌株的生长情况，和聚磷菌、反硝化菌进行了初步复配，提供了一种快速有效的富集筛选反硝化聚磷菌方法，为反硝化除磷脱氮机理的进一步研究奠定基础.1 试验1.1 反硝化聚磷菌富集装置及运行方式从生物脱氮除磷的机理分析来看，生物脱氮除磷工艺基本上包括厌氧、缺氧、好氧3种状态，这3个不同的工作状态可以在空间上进行分离，也可以在时间上进行分离［9-10］.本实验采用按时间顺序进行的SBR反应器作为富集装置.试验采用的是两个直径25 cm、高50 cm圆柱形SBR反应器，工作容积为19 L.试验装置如图1所示.反硝化聚磷菌的富集采用高注水比和两段进水的运行方式降低COD与硝酸盐共存的可能性，强化聚磷菌的选择优势.同时在进水质量浓度一定的情况下提高污泥的营养负荷，加快细菌增殖的速度，达到快速富集DPB的目的.反硝化聚磷菌的富集采用图2所示运行方式，反应器每天运行3个周期，每个周期两次进水、两次排水，注水比0.67(进排水体积与工作容积之比).在富集期间不排泥，厌氧段开始进入只含乙酸钠COD为250 mg/L的配水;缺氧段开始进入含PO43-和的配水，进水P质量浓度约为19 mg/L，质量浓度根据需要加入.图1 反硝化除磷SBR反应器装置图图2 A2SBR反硝化聚磷菌富集驯化的运行方式1.2 反硝化聚磷菌的分离、筛选聚磷菌是在厌氧和好氧条件下都能生存的兼性菌，稀释混合平板法分离效果要比稀释涂布平板法效果好，对于聚磷菌的分离采用稀释混合平板法比较有效［11］.在分离反硝化聚磷菌过程中，采用稀释混合平板法.根据已有资料显示，DPB的分离比较困难，可能需要某些生长因子才能生长.一般在其他菌群存在时，DPB才可能生长，因此，前期并未采用含磷培养基来选择富集，初步分离采用适于大多数微生物生长繁殖的普通牛肉膏蛋白胨培养基.缺磷培养基:无水乙酸钠5 g;Na2HPO4·2H2O 0.023 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCl2·H2O 0.2 g; (NH4)2SO42.0 g;蒸馏水1 000 mL;微量元素1 mL.含磷培养基:无水乙酸钠5.0 g;KH2PO4 0.125 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCl2·H2O 0.2 g; (NH4)2S O42.0 g;蒸馏水1 000 mL;微量元素1 mL(45 mg/L NO3--N由KNO3提供，根据试验需要加入).筛选试验以磷为检测指标，菌株在缺磷培养基中30℃培养24 h后，测量其培养后菌液OD值，用无菌水调节OD值一致后加入富磷培养基，定时取样测定-P质量浓度的变化，考察各株菌对于培养液中的吸磷效率，辅以硝酸盐还原试验、PHB染色、Poly-P颗粒染色镜检试验，初步筛选出硝酸盐还原阳性且聚磷效果较好的菌株，测量方法参见表1.进一步试验是以硝氮为指标，考察DPB的同步脱氮除磷效能，将加有KNO3的富磷培养基高温灭菌后分装在密闭容器中，取30℃培养24 h后饱和菌液调节OD值一致后加入，充氮除氧，采用磁力搅拌器进行混合，定时取样测定P-P和-N质量浓度的变化，测量方法见表1.最终得到聚磷效果稳定、高效具有反硝化功能的菌株DPB.表1 水质分析项目与方法重铬酸钾法ρ(NO3--N)/(mg·L-1) 麝香草酚光度法ρ(PO3-4-P)/(mg·L-1) 钼锑抗分光光度法pH pH电极ORP ORP电极DO 溶解氧分析仪MLSS分析项目分析方法COD/(mg·L-1)重量法1.3 聚磷菌的复配由于污水处理系统的复杂性，微生物的纯培养无法完全再现实际脱氮除磷系统情况，故经常出现纯培养与实际观测不一致的情况.实际的反应器是由各种微生物组成的一个生态系统，并不仅仅是依靠某一种菌单独起作用，而是需要各种功能菌相互作用共同完成系统功能.为了初步模拟反应器中微生物的相互作用对聚磷的影响，实验对经过筛选出的菌进行随机两两复配.方法如下:用无菌水调节待复配菌株菌液OD值一致后等比例加入含KNO3的富磷培养基的密闭容器，然后置于30℃培养，充氮除氧，采用磁力搅拌器进行混合，定时取样测定PO43--P和-N质量浓度的变化，对比培养前后单株菌的脱氮除磷效率.2 结果与分析2.1 反硝化聚磷菌富集在不到半个月的富集驯化期内，通过高注水比和两段进水的特定运行方式保障反硝化除磷菌在系统中的快速增殖.随着富集运行时间的增加，净吸磷量总体呈上升趋势，系统的净吸磷量逐渐升高.缺氧段去除的硝酸盐也逐渐增加(见图3、4)，反应器的净吸磷增加到约4 mg/L，缺氧段去除的硝酸盐达58 mg/L，去除率达100%，系统达到明显的反硝化除磷效果.图3 反硝化聚磷菌富集期系统净吸磷量图4 反硝化聚磷菌富集期系统硝氮去除在富集驯化末期，A2SBR系统趋于稳定，将反应器改为厌氧/缺氧/沉淀的方式运行，监测运行周期内反硝化除磷系统中可溶性磷质量浓度、COD质量浓度和硝酸盐质量浓度的去除情况(见图5).在厌氧阶段，COD质量浓度整体呈下降趋势，磷质量浓度逐渐增加，表现出明显的释磷现象，在厌氧阶段末期，体系中磷质量浓度增加到24.9 mg/L.进入缺氧阶段的第1小时内，检测到了强烈的反硝化吸磷现象，每克MLSS吸磷平均速率为4.89 mg/h，每克MLSS反硝化平均速率为6 mg/h，单位PO43--P可消耗的-N 量为1.22 mg/mg.经过4.5 h的缺氧阶段，系统中磷质量浓度和硝酸盐质量浓度分别下降到0.47 mg/L和3.4 mg/L，系统除磷和脱氮率高达95%和94%，去除的碳氮比为3.8、碳磷比为22.周期试验缺氧段吸磷过程硝酸盐氮的消耗量和磷的吸收量呈现了较好的线性关系，此时反应系统已经存在大量能以NO3--N为电子受体进行吸磷的反硝化聚磷菌，DPB成为SBR系统中的优势菌种.高注水比和两段进水的特定运行方式对反硝化除磷菌的富集驯化快速有效，可使反硝化除磷系统在较短的时间内完成富集过程.图5 A2SBR富集驯化末期周期试验2.2 反硝化聚磷菌的分离、筛选反硝化聚磷菌是将摄磷和反硝化这两个不同的生物过程在同一体内完成的一种兼性厌氧菌［12］.硝酸盐还原性阳性(生物反硝化脱氮)是细菌的一种无氧呼吸形式;异染颗粒(细菌超量吸磷)是细菌的一种能量贮备形式，它们是两种并不冲突的细菌生化特性.硝酸盐还原性为阳性且产气，菌体内含有异染颗粒或聚-β-羟基丁酸颗粒，既能反硝化脱氮，又能厌氧释磷;在好氧(O2)或缺氧(NO3-)状况下超量吸磷的细菌即可称为反硝化聚磷菌［13］.基于此，对已分离纯化的备选菌种进行了吸磷试验、硝酸盐还原产气试验及异染颗粒和PHB颗粒染色辅助检验(见表2)，来实现筛选得到同步脱氮除磷效果都较好DPB.表2 筛选结果 %菌株24 h吸磷率48 h吸磷率24 h脱氮率48 h脱氮率PHB 异染颗粒b31 21.93 86.56 25.66 54.48 + -a13 18.81 57.93 90.54 92.14 - -b3 21.96 58.75 93.57 94.90 - -b11 - 63.81 - 94.77 - -a5 27.73 78.87 70.26 73.33 + + b3b 32.72 85.08 75.41 74.53 + + b9 40.14 85.35 80.16 84.96 + + a2 42.30 83.32 76.30 78.68 + + b204 67.09 71.06 94.95 94.41 + +2.3 反硝化聚磷菌的鉴定利用Shelock脂肪酸鉴定系统，结合部分菌株生理生化试验、菌株个体形态、菌落形态观察对所筛菌株进行菌属综合鉴定，将菌株鉴定到属，结果见表3.早期研究认为不动杆菌属为除磷系统中典型的优势菌种，但随着研究的深入发现不动杆菌属只是少数菌属，并不占优势，只占总量的1% ～10%，而其他微生物的除磷能力更不容忽视，优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)和气单胞菌属(Aerodomonas).气单胞菌属能够过量摄取废水中的磷酸盐形成聚磷酸盐胞内物质;假单胞菌属具有除磷菌的共性，即在厌氧条件下释放磷和在好氧条件下过量摄取磷，并能够累积聚磷酸盐［14-15］.试验所分离鉴定的菌种涵盖不动杆菌、假单胞菌属、气单胞菌属、粘液奈瑟菌、弗氏柠檬酸杆菌，筛选结果与已有研究较为一致. 表3 聚磷菌鉴定结果菌株菌属a5Aeromonas-ichthiosmia b31 Citrobacter freundii b11 Neisseria-mucosa b204Pseudomonas-stutzeri2.4 菌种复配对经过前期筛选聚磷效果较好的菌16、19，有同步反硝化能力的b11、a5、b204，反硝化率较高的GS进行随机复配.从图6可以看出，6种复配方案中b11×a5、b11×b204、19×GS、b204× 16的效果较好，都达到了氮、磷同步去除要求.其中24 h复配效果最好的是b204×16，吸磷率为85.78%，脱氮率为75.02%，相对于b204单菌除磷效果67.09%，复配后吸磷效果突出，达85.78%，除磷效果得到显著提高，复配后脱氮效果虽有所下降，但也维持在较高的75.02%水平，达到了同步脱氮除磷的目的.复配前16号菌虽然除磷效果很好(94.86%)，但对于脱氮却没有贡献，而复配后在保持较高除磷效果的同时也达到了较高的脱氮效果.说明二者在生态关系上互补，通过各自的代谢活动进行功能上的互补，从而实现了同步脱氮除磷效果的提高，具有作为脱氮除磷生物强化菌剂的潜在价值.图6 复配结果复配方案中16×GS的效果最差.两株菌的单株处理效果都不错，其中的16号菌除磷效果很好，而好氧反硝化菌GS具有较高的脱氮能力.但菌株复配不但没能提高处理效果，复配后反而失去除磷能力，脱氮能力也有所下降.分析原因可能是GS菌株代谢过程产生了某种抑制物，从而使菌16的生长受到抑制，并导致菌16的最终死亡.在这个过程中16号菌与GS产生竞争，对GS也产生了不利影响，引起脱氮效果的下降.GS菌株是聚磷菌16的抑制菌群，GS菌对于除磷是有害的，复配并未提高处理效果.3 结论1)厌氧/沉淀排水/缺氧/沉淀排水和较高注水比的运行方式避免了C、N共存的情况，对快速富集反硝化聚磷菌十分有利，能在较短时间使反硝化聚磷菌迅速成为优势菌.2)实验以磷为检测指标，综合磷吸收试验、硝酸盐还原试验、PHB染色、Poly-P颗粒染色的分离筛选方法，从富集驯化A2SBR反应器中分离得到效果较好的反硝化聚磷菌，鉴定为 a5: Aeromonas-ichthiosmia;b204:Pseudomonasstutzeri;b31:Citrobacterfreundii;b11:Neisseria -mucosa.3)b204和菌16组合方案可以作为潜在脱氮除磷生物强化菌剂.b204与聚磷菌和反硝化菌复配，复配效果最好的是 b204和 16，吸磷率为85.78%，脱氮率为75.02%，相对于单菌株均表现出了较好的脱氮除磷效果.复配效果最差的是聚磷菌16和反硝化菌GS组合，复配后不具有吸磷能力，脱氮率为70.09%，相对于单菌株处理能力降低，聚磷菌和反硝化菌两类菌的复配未能达到同步脱氮除磷目的.参考文献:［1］ WACHTMEISTER A，KUBA T，LOOSDRECHT van M C M，et al.A sludge characterization assay for aerobicand denitrifying phosphorus removing sludge［J］. 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摘要：目的研究反硝化聚磷茵除磷特性，筛分同时具有反硝化和吸磷能力的菌种．方法采用平板分离和ＤＧＧＥ技术相结合，对实验室反硝化除磷系统菌种进行分纯和菌种鉴定，并对富集培养后的每株单茵分别进行反硝化吸磷效果试验．结果最终共得到１５株单菌．结果表明有１ｌ株菌均具有不同程度反硝化吸磷能力，其中假单胞茵属的ＪＢ２和产碱菌属的ＪＢ３脱氮除磷效果最好，８ｈ后磷的去除量分别为１３．７６ｍｇ／Ｌ和１１．８５ｍｇ／Ｌ．ＤＧＧＥ试验结果表明，系统中反硝化聚磷茵优势种群可主要分为７个群，分别是Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂａｃｔｅ— ｒｏｉｄｅｔｅｓ，ＴＭ７，理一ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，８一ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ和ｙ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ菌群．结论Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅ— ｍ中的ＬＢ９号菌和ｙ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ中的ＪＢ２号茵为反硝化除磷系统中占优势的反硝化聚磷茵．试验结果同时证明同一菌种可以同步完成反硝化和吸磷任务．
在前８ｈ的吸磷量仅为０．４２ｍｇ／Ｌ和０．６６ｍｅ，／ＪＬ７、ＪＢ２、ＪＢ３和ＪＢ４６株具有反硝化能力，而其
ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ，ＴＭ７，ａ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，艿一ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ和ｙ—ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ菌群．经平板分离、除磷和ＤＧＧＥ试验，确定属于ｙ—ｐｒｏ— ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌属的ＪＢ２菌株和Ａｃｔｉ－ｎｏｂａｃｔｅｒｉａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ的ＬＢ９为反硝化除磷系统中的优势反硝化聚磷菌．
（３）变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）分析；（４）克隆测序．
２试验结果与讨论
２．Ｉ菌种分离鉴定结果２．Ｉ．１反硝化菌的分离鉴定
利用反硝化菌培养基得到６株具有明显反硝化效果的反硝化菌，生理生化试验和检索结果表明，这些菌种分别属于ＬＢ２弧菌科（Ｇａｍｍａｐｒｏ－ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科）、ＬＢ３肠杆菌科（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科）、ＬＢ４假单胞菌属（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｐｓｅｕｄ— ｏｍｏｎａｓ科）、ＬＢ５肠杆菌科、ＬＢ８气单胞属（Ｇａｍ－ｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科）、ＬＢ９微球菌属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ纲，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ科）．２．１．２聚磷菌分离鉴定结果
（Ｉ）基因组ＤＮＡ的提取采用无菌移液管于反应器中部吸取２ｍＬ活性污泥，立即置于冰上，用于总ＤＮＡ的提取．取０．５一１．０ｍＬ污泥置于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，转速１００００离心ｌｍｉｎ，弃去上清液，获得污泥沉淀Ｏ．２５—０．５ｍｇ，采用Ｍｏｂｉｏ土壤ＤＮＡ提取试剂盒（Ｍｏｂｉｏ，ＣＡＵＳＡ）提取总ＤＮＡ，最终溶解于
利用硝酸根为电子受体吸磷的能力．
和０．９１ｍｇ／Ｌ，２０ｈ后的吸磷量达到了３．３２ｍｇ／２．２．２聚磷菌的吸磷试验
Ｌ、４．６４ｍｇ／Ｌ、２．４９和２．７４ｍｇ／Ｌ；弧菌科的菌株
试验中发现９株聚磷菌好氧吸磷能力都很
ＬＢ２和气单胞菌属的菌株ＬＢ８的吸磷能力较弱，强，但是通过生理生化试验发现只有ＪＬ２、Ｊ１．，４、
关键词：反硝化菌；聚磷菌；平板分离；ＤＧＧＥ
中图分类号：Ｘ１７２
文献标志码：Ａ
Ｏ引言
聚磷和反硝化是污水生物除磷脱氮过程中两个十分重要的反应过程，随着除磷脱氮技术在微生物领域研究的不断深入，聚磷菌和反硝化菌也逐渐被人们认识和了解¨。２］．有学者认为在传统的除磷脱氮工艺中，不动菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ）是除磷菌中占优势的菌种∞Ｊ，假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏ· ｍｏｎａｓ）则是反硝化菌中占主导地位的菌种＂。．８０年代中期至今反硝化吸磷现象已经被人们所确认，并且Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等（１９９５）从微生物学角度也证实了同一菌种能够完成反硝化同时吸磷的任务，但是他同时也指出，聚磷菌中的Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ并不具有反硝化能力∞ｊ．而且另有研究表明Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ在除磷系统中数量上并不占优势ＭＪ．目前普遍认为除磷菌的种类是多样的，很
多菌种都具有聚磷能力，但是还存在很多问题没有解决．譬如利用传统分离技术分离聚磷菌种类很有限；而利用分子生物学手段得到的诸多菌种缺少生理生化方面的验证等问题＂Ｊ．
笔者利用传统的平板分离技术和ＤＧＧＥ技术相结合，对实验室反硝化除磷系统聚磷菌菌群结构组成、菌种生理生化特性进行了深入研究．最终得到具有反硝化效果的反硝化菌６株，聚磷菌９株．同时分析认为系统中反硝化聚磷菌优势种群可主要分为７个群，分别是Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ，Ａｃｔｉ—
反硝化菌和聚磷菌共１５株，各类菌种所占菌种总数（划分到纲）比例如图ｌ所示．
图１各类菌种所占菌种总数比例
Ｏ９８７６５
（１奄Ｅ芰ｈ＾）ｄ一文４
３
２●
在这１５株菌中，经鉴定有６株属于Ｇａｍｍａ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ种，占总数的４０％，Ｂａｃｉｌｌｉ和Ｂｅｔａｐ－ｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ各４株，占２６．７％，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ占
ＧＣＴＧＧＣ一３’）（ＧＣ夹序列为：５’一ＣＧＣＣＣＧ
ＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣ
ＣＣＧＣＣＣＧ一３’）．ＰＣＲ反应体系１００止的ＰＣＲ反应体系组成如下：１０×ｂｕｆｆｅｒ１０止（ｐｌｕｓＭ９２＋），１０％ＢＳＡ１此，引物各３ｐＬ（２．４ＩｘＭ），
ｄＮＴＰ８ＩｘＬ（８００斗Ｍ），ＥｘＴａｑ酶３．２Ｕ（宝生物，大连），模板５０ｎｇ一１００ｎｇ．ＰＣＲ反应条件反应程序为：预变性９４℃，５ｍｉｎ；并接以３０个循环包括，９４℃变性４０Ｓ，５３℃退火４０Ｓ，７２℃延伸ｌｍｉｎ，循环完毕，７２℃延伸５ｍｉｎ．采用琼脂糖电泳分析ＰＣＲ产物的浓度和质量；
ＣＨ３ＣＯＯＮａ·３Ｈ２０，２８．７３ｍｇＮａ２ＨＰ０４·２Ｈ２０，５７．２７ｍｇＮＨ４ＣＩ，１３１．８２ｍｇＭｇＳ０４·７Ｈ２０，２６．７４ｍｇＫ２Ｓ０４，１７．２ｍｇＣａＣｌ２·２Ｈ２０，１２ｇ
ＨＥＰＥＳ缓冲溶剂，１５ｇ琼脂和２札微量元素，
ｐＨ７．０．微量元素构成：每升蒸馏水加人５０ｇＥＤ·
６．６％．
２．２菌种反硝化吸磷试验结果利用两种培养基分离出６株反硝化菌和９株
聚磷菌，共１５株菌，其中聚磷菌中ＪＬ２、ＪＬ４、ＪＬ７、ＪＢ２、ＪＢ３和ＪＩＭ６株具有反硝化能力，而其中ＪＬ４菌株的扩大培养没有成功，因此，本试验中只考察
了ＬＢ２、ＬＢ３、ＬＢ４、ＬＢ５、ＬＢ８、ＬＢ９、ＪＬ２、ＪＬ４、ＪＬ７、ＪＢ２、ＪＢ３和ＪＢ４１１株菌株的反硝化吸磷特性．２．２．１反硝化菌种的反硝化吸磷结果
２００９年０５月第２５卷第３期
沈阳建筑大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈｅｎｙａｎｇＪｉａｎｚｈｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）
文章编号：１６７１—２０２１（２００９）０３—０５３５—０６
Ｍａｙ２００９Ｖ０１．２５，Ｎｏ．３
反硝化聚磷茵菌种筛分与除磷特性分析
收稿日期：２００７—０９—２０基金项目：国家自然科学基金项目（Ｅ０８００４０２）；北京市水质科学与水环境恢复工程蕈点实验室开放基金项目
（０８ＵＷＨＣｌ０）；城市水资源与水环境国家重点实验室开放基金项目（０８ＵＷＨＣｌ０）作者简介：焦中志（１９７６一），男，博士后，主要从事污水处理及污水资源化方面研究．
对缺氧池内的聚磷菌进行了二次分离，第一次采用了直接对活性污泥进行稀释、分离和纯化的方法，第二次采用先富集培养后分离的方法，两次共分得９株聚磷菌．其中几ｌ、ＪＬ２、ＪＬ４、ＪＬ５、ＪＬ７为第一次分得，ＪＢｌ、ＪＢ２、ＪＢ３、ＪＢ４为第二次分得．生理生化试验和检索结果表明这些菌种分
万方数据
第２５卷
６株具有明显反硝化效果的反硝化菌吸磷试验结果如图２（ａ）、（ｂ）所示．
３２ｌＯ９８７６３瓷ｇ董一ｃ弓ｑ５４３２ｌ
ｔｌｈ
（８）６株反硝化菌吸磷曲线
ｔｌｈ
（ｂ）６株反硝化菌硝酸氯降解曲线
圈２反硝化菌反硝化吸磷效果
从图２（ａ）、（ｂ）可以看出这６株反硝化菌在始下降．对应图２（ａ）、（ｂ）还可以看出，磷酸根的
将分离出来的反硝化菌和聚磷菌富集培养，在限磷培养液（Ｐｑ＋≤４ｍｇ／Ｌ）中厌氧培养２４ｈ，然后在富含磷和ＮＯ；的培养液中厌氧培养２０ｈ以上，检测培养液中硝酸氮和磷的质量浓度变化．ＮＯ，－一Ｎ采用麝香革酚分光光度法，ＰＯｉ一一Ｐ采用氯化亚锡还原光度法．１．４ＤＧＧＥ试验
对不同碳源条件下反硝化除磷系统污泥样品进行分析：
反硝化的同时都具有不同程度的吸磷能力．肠杆吸收和硝酸根的降解对应并不明显，这类菌株反
菌科的两株菌ＬＢ３、ＬＢ５，微球菌属的ＬＢ９和假单硝化的能力要远超出其吸磷能力．但利用反硝化
胞菌属的菌株ＬＢ４的吸磷能力较强，在前８ｈ的菌培养基培养出来的这６株菌，都具有不同程度
吸磷量分别为１．７４ｍｇ／Ｌ、２．１６ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ
ＴＡ，５ｇＦｅＳ０４·７Ｈ２０，１．６ｇＣｕＳ０４·５Ｈ２０，５ｇＭｎＣｌ２·４Ｈ２０，１．１ｇ（ＮＨ４６Ｍ０７０２４·４Ｈ２０，
５０ｍｇＨ３８０３，１０ｍｇＫＩ和５０ｍｇＣｏＣｌ２·
６Ｈ２０［８１．
１．２分离与鉴定分离采用平板分离法一Ｊ．对分离纯化后的菌
株进行革兰氏染色，葡萄糖氧化发酵，接触酶，氧化酶等一系列生理生化实验，然后进行检索鉴定‘１０｜．１．３反硝化吸磷试验分析方法
（２）基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增使用ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ的ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００型基因扩增仪．以大多数细菌和古细菌的１６ＳｒＲＮＡ基因Ｖ３区通用引物扩增引物