免疫组化操作步骤

第一节免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考）第二节免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）（一）、仪器设备

1.18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.

2.水浴锅

（二）、试剂

1.PBS缓冲液（一）

2.L柠檬酸钠缓冲液（CB,,1000m）

3.3%甲醇一H

20

2溶液：用30%H

20

2和80%甲醇溶液配制

4•风裱剂：a.甘油和L碳酸盐缓冲液（-等量混合b油和TBS （PBS）制

5. TBS/PB-适用于荧光纤维镜标本；适合光学纤维标本

（三）、操作流程

1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60C恒温箱

中烘烤20分钟。

a组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后在浸泡10分钟

b无水乙醇中浸泡五分钟

C95%乙醇中浸泡五分钟

d75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

抗原修复（免疫组化石蜡切片）用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复

福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露

抗原，以不出现明显脱片现象为佳。

抗原修复的几种常用方法（供参考）

1.微波炉加热：在微波炉里加热枸椽酸钠缓冲液（）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热"-3 5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。

适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本：

2•沸热修复：电炉或水浴锅加热枸椽酸钠缓冲液（）至95 C左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

3•高压热修复：在沸水中加入EDTA或枸椽酸钠缓冲溶液（）•盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复）

4.酶消化方法：

常用％胰蛋白酶和％胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37C,消化时间约为

5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：

包括.等

石蜡切片免疫组化染色步骤

1 •三步法（以SP试剂盒为例）

•石蜡切片脱蜡至水

•蒸馆水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。

・3%H2O室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS中

洗，2分钟X3次。

・5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37C孵育1 ~2小时或4C过夜。

・PB冲洗，2分钟X3次。

•滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PB稀释)，37C孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37 C或室温孵育10〜20分

钟。

・PB冲洗，2分钟X3次。•滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素

(PBS稀释)，37C孵育10〜30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 C或室温孵育10-20分钟。

・PB冲洗，2分钟X3次。

•显色剂显色(DAB或AEQ

•自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片

•如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素。

法

(1 )脱蜡、水化

(2)PBS洗2次各5分钟

(3)用蒸馆水或PBS配制新鲜的3%H2O2室温封闭5-10分钟，用蒸馆水洗3次

(4)抗原修复

(5)PBS洗5分钟

(6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体

(7)滴加抗50ul,室温静置1小时或4C过夜或37C 1小时

(8)PBS洗3次各2分钟

(9)滴加生物素化H抗，20C -37C 20分钟

(10)PBS洗3次各2分钟

(11)滴加试剂SABC 2© -30 C 20分钟

(12)PBS洗4次各5分钟

(13)DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色

(14)脱水、透明、封片、镜检。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

•速冻组织

•冰冻切片4~8呵，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20C冰箱。•室温放置30分钟后，入4C丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其他的固定方式。

・PB冲洗，5分钟X3次。

•用3%过氧化氢孵育5- 1 0分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

・PB冲洗，5分钟X3次。

•下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。

第二节免疫组化抗原热修复的技术要点(供参考)

1、抗原热修复温度和时间的关系

我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，具体过程如下：

第一步基本反应福尔马林和氢反应形成新的化合物

第二步基本反应福尔马林和氢反应形成新的亚甲基桥

上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭，而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间，有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式：

抗原热修复的有效性二加热温度（丁） X加热时间（t）

也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长；反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短，才能使抗原决定簇完全暴露，这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表1中也可以清楚地看出。

时间和温度对染色的影响

时间（分钟）

100C 80C60C

5x2+ + + ----

5x6+ + + ++ + + —

5X 10 — + + + ++

10小时一一 + +

如果修复强度不够，免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露的部分抗原决定簇，而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱，或岀现假阴性，即使是阳性结果，充其量只能起到定性的作用，不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊