2蛋白质的显色反应
蛋白质的呈色反应
蛋白质的呈色反应
蛋白质的呈色反应
蛋白质是有机体中主要的结构和功能物质。
它是由氨基酸构成的高分子物质，具有独特的化学性质。
它会发生各种反应，其中最常见的是呈色反应。
蛋白质的呈色反应主要是指蛋白质与某些物质发生反应时，蛋白质会产生颜色变化的现象。
这种反应是通过氨基酸残基中存在的含氮杂环结构，将反应物对应的原子或分子重新排列形成新的结构而导致。
蛋白质的呈色反应常以胆红素和卟啉胆素为代表，当这些物质染料与蛋白质发生反应时，蛋白质会产生特殊的颜色，这种颜色的深浅可用来表征蛋白质的种类、结构和功能。
蛋白质的呈色反应在医学检测、环境检测、食品安全监测等领域都有重要的应用。
例如，在医学检测中，可以利用呈色反应来诊断疾病；在环境检测中，可以观察水体中污染物的蛋白质的呈色反应来判断水质；而在食品检测中，可以通过蛋白质的呈色反应来检测食品的新鲜程度。
因此，蛋白质的呈色反应对于人类的工作和生活来说非常重要，对于我们的健康和安全也有很大的保障作用。
- 1 -。
最新实验一 蛋白质及氨基酸的显色反应(验证)
操作步骤:
一、取一支试管加4滴0.5%苯酚溶液，再加浓 硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入10% 氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩 脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反 应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。
操作步骤
一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火 加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停 止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后， 加10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入 1%CuSO４溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜 色。避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化 铜能掩盖粉红色。
二、在一小片滤纸上滴上一滴0.5%的甘氨酸 溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮 乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察 紫红色斑点的出现。
Ⅲ、黄色反应 (Xanthoproteic reaction)
原理
凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用 产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性 溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。
管号
１
0
0.3％ 蛋白质 20％ α －萘 NaClO 现象
精氨 溶液 NaOH 酚
记录
酸
0
5
5
3
6
２
0
5
0
5
3
6
３
5
0
0
5
3
6
Ⅴ、乙醛酸反应 (AdamkiewicaHopkins-Cole reaction)
生物化学实验
2008—2009 学年度第 一 学期
开课单位 课程名称 授课班级 任课教师
水产学院 生物化学实验 养殖 0713 韩芳
试验一蛋白质显色反应和氨基酸纸层析
（一） 蛋白质的显色反应
一、 目的要求： 1、 理解蛋白质具有双缩脲反应。 2、 理解蛋白质和α--氨基酸均能与茚三酮作用产生有色化合物。 3、 了解氨基酸、蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应、米伦氏反应
二、教学方法和教学学时： 1、教学方法：学生操作实验，教师指导。 2、教学学时：4 学时。
三、实验内容： 以桔络、作实验样品，用 10 倍量的 1%盐酸抽提（研磨），制得 50ml 抽
提液；用 1%盐酸作空白液。脉动和鲜橙多饮料，离心后的6—二氯酚靛酚滴定法测定该抽提液或样品液中 VC 的含量。
六、思考题
1．常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？
2．考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定
量法？
3．如何正确使用分光光度计？
七、作业：完成实验报告。
实验四 还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）
一、目的要求：
1、掌握用硝基水杨酸比色法测定样品中总糖和还原糖含量。
（1）标准曲线的制作
取 6 支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
管号
12345 6
蛋白质标准液（ml）
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（ml）
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝 G-250 试剂（ml）
55555 5
蛋白质含量（μg）
0 20 40 60 80 100
（二） 氨基酸的纸层析法分离
蛋白质的颜色反应和沉淀反应
蛋白质作为食品添加剂
ห้องสมุดไป่ตู้
01
蛋白质可以作为食品添加剂，如乳化剂、增稠剂等，改善食品
的口感和质地。
蛋白质作为营养强化剂
02
蛋白质可以作为营养强化剂添加到食品中，提高食品的营养价
值。
蛋白质在功能性食品中的应用
03
蛋白质可以用于制备功能性食品，如低脂、低糖、高纤维等。
在农业领域的应用
1 2
蛋白质作为肥料
蛋白质可以作为有机肥料，提供植物所需的营养 元素，促进植物生长。
质谱分析法
总结词
通过测量蛋白质离子的质量和电荷比值，可 确定蛋白质的分子量和结构。
详细描述
质谱分析法利用高能电子束或激光将蛋白质 离子化，然后在电场和磁场中进行分离和检 测。通过测量离子的质量和电荷比值，可以 确定蛋白质的分子量和结构。质谱分析法具 有高灵敏度和高分辨率的特点，是蛋白质纯 度检测的重要手段之一。
详细描述
考马斯亮蓝G-250是一种灵敏的染料，可以与蛋白质结合产生颜色变化，通过比色法可以测定蛋白质的含量。该 方法具有高灵敏度和准确性，被广泛应用于生物化学实验中蛋白质的定量分析。
02
蛋白质的沉淀反应
盐析法
总结词
通过向蛋白质溶液中加入高浓度的盐 溶液，降低蛋白质溶解度，使其从溶 液中沉淀出来。
紫外吸收法
总结词
紫外吸收法是一种利用蛋白质在紫外光区有特征吸收峰 的性质来定量测定蛋白质含量的方法。
详细描述
紫外吸收法的基本原理是蛋白质分子中的共轭双键在紫 外光区有特征吸收峰，通过测定特定波长下的吸光度值 ，可以计算蛋白质的含量。该方法具有较高的灵敏度和 准确性，适用于测定各种蛋白质，包括球蛋白、纤维蛋 白等。
实验二蛋白质的显色反应
4 考马斯亮蓝反应 1原理 考马斯亮蓝G250R250具有红色和蓝色两种色调; 在酸性 溶液中;其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过 疏水作用结合后变为蓝色; 它染色灵敏度高;比氨基黑高3倍; 反应速度快;约在2分 钟左右时间达到平衡;在室温一小时内稳定; 在0 01 ～1 0mg蛋白质范围内;蛋白质浓度与A595nm值成正比; 所 以常用来测定蛋白质含量;
实验报告不能用铅笔写;
3 黄色反应 1原理 含有苯环的氨基酸;如酪氨酸 色氨酸;遇硝酸后;可被硝化 成黄色物质;该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色 的硝醌酸钠; 反应式如下：
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸;所以呈黄色反应;苯 丙氨酸不易硝化;须加入少量浓硫酸才有黄色反应;
2试剂 ①鸡蛋清溶液将新鲜鸡蛋清用6层纱布过滤;然后按鸡蛋 清：水=1：20配制而成;
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所
有;CH2NH2; CSNH2; CHRNH2; CH2NH2CHNH2CH2OH 或CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等 物质也有此反应; NH3也干扰此反应;因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色 的络离子CuNH342+; 因此;一切蛋白质或二肽以上 的多肽都有双缩脲反应;但有双缩脲反应的物质 不一定都是蛋白质或多肽;
该反应的适宜的PH为5～7;同一浓度的蛋白质或氨基 酸在不同pH条件下的颜色深浅不同;酸度过大时甚至不显 色;
该反应分为两步;第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸; 酮酸脱羧成醛;放出CO2 NH3;水合茚三酮被还原成还原
型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个 水合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质; 反应机理如下：
②大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再 用纱布过滤; ③头发; ④指甲; ⑤0 5%苯酚溶液; ⑥浓硝 酸; ⑦0 3%色氨酸溶液; ⑧0 3%酪氨酸溶液; ⑨10%氢氧 化钠溶液; 3操作 向7个试管中分别按下表加入试剂;观察各管出现的现象; 有的试管反应慢可略放置或用微火加热; 待各管出现黄 色后;于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性;观察 颜 色变化1 ～4管可能需要加热;
实验4蛋白质的颜色反应和沉淀反应
A.双缩脲反应
1. 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化 并形成双缩脲，释出的氨可用湿润红色石蕊试纸试之。 至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加 10%NaOH 溶液1ml 混匀， 1%CuSO4溶液2滴，观察 有无紫色出现。 2. 另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶 液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫 瑰色。
乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。
C.重金属盐沉淀蛋白质
取试管2支各加蛋白质溶液2 ml，一管内滴加1%醋酸铅溶 液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。
蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。
D.生物碱试剂沉淀蛋白质
取试管2支各加蛋白质溶液2 ml及1%醋酸溶液4-5滴，向 一管内滴加5%鞣酸溶液数滴，另一管内滴加饱和苦味酸 溶液数滴，观察结果。
A.蛋白质盐析作用
1. 取蛋白质溶液3 ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（50%饱和浓度）， 微微摇动试管，使溶液混合静置5 min，此时析出的为球蛋白； 2. 将上述混合液过滤，滤液中加入约一药匙硫酸铵粉末，至不再溶 解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
B.乙醇沉淀蛋白质
取蛋白质溶液1 ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全）， 待溶解后再加入95%乙醇2 ml混匀。观察有无沉淀析出。
实验四 蛋白质的颜色反应和沉淀反应
I. 蛋白质的颜色反应
1. 目的： 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
2. 原理： 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反 应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜 色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同 颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是 蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。
蛋白质的显色反应
蛋白质的显色反应集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-实验二蛋白质的显色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。
2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应1、双缩脲反应（1）原理：尿素加热至180o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
反应式如下：双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH2,-CH2-NH2,-CHR-NH2,-CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH或-CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。
NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
（2）试剂①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水=1：9）（3）操作取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10%氢氧化钠溶液约1mL ，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色）向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水=1：9）约1mL 和10%氢氧化钠溶液约2mL ，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
2、茚三酮反应 (1)原理蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有?-氨基酸均能发生该反应，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。
实验---蛋白质的沉淀反应与颜色反应
实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。
二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。
不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。
另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。
蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。
如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
三、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、pH试纸6、水浴锅7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。
2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸〔水浴加温助溶〕溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。
此试剂可长期保存。
4、尿素晶体5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。
18、1%醋酸溶液。
五、实验步骤蛋白质的颜色反应〔一〕米伦〔Millon’s〕反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millon’s试剂，电炉小心加热观察颜色变化。
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实验二蛋白质的显色反应
一、实验目的
1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。
２、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应
1、双缩脲反应
(1)原理:
尿素加热至1８０o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物,此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
反应式如下：
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个－CS-NH2， -Ｃ
H2－NH2, -CHR-NＨ２, －CH2-NH2－CH－NH2－CH2-OH或-ＣHOＨCH2ＮH２等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。
NH３也干扰此反应,因为NH3与Cu２+可生成暗蓝色的络离子Ｃｕ(NH3)42+。
因此,一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
（2)试剂
①尿素,②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：９）
（３）操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热,尿素放出氨,形成双缩脲。
冷后，加1０%氢氧化钠溶液约1mL,振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴,再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜,否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
（由于杂质以及氨气的干扰,导致颜色不都是紫红色）
向另一试管加2%卵清蛋白溶液(改为蛋清溶液:水＝ 1：9)约1mL和10％氢氧化钠溶液约2mL,摇匀,再加１％硫酸铜溶液2滴,随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
2、茚三酮反应
(１) 原理
蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有 －氨基酸均能发生该反应，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物,最终生成蓝色化合物。
氨、β－丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。
尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此,虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应,但能与茚三酮反应呈阳性反应的不一定都是蛋白质或氨基酸。
该反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸,酮酸脱羧成醛，放出CＯ2、NＨ3,水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质。
反应机理如下：
该反应非常灵敏，1:15０万浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
但在定性、定量测定中,一方面要严防干扰物存在，另一方面要在适宜的PH 条件下进行测定。
该反应的适宜的PH 为５~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。
(2）试剂
①蛋白质溶液：2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清:水=1：9)，②０.5%甘氨酸,③0．１％茚三酮水溶液，④0.1%茚三酮－乙醇溶液。
（３）操作
①取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1mL,再各加０.５
mL0.
１%茚三酮水溶液,混匀,
C
C
C OH
OH +
H 2N
H COOH
R
O
O C
C C OH
H
+
NH 3
+CO 2+R
C
O
H
O O
还原型茚三酮
C
C C OH
H +
NH 3
O O
还原型茚三酮
+
C C C
HO
HO
O
O
C
C
C O O
H N
C
C C
O O +
3H2O
蓝紫色
在沸水浴中加热1~2分钟,观察颜色由粉色变紫色再变蓝色（pH 不同颜色深浅不同)。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液,风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮－乙醇溶液，在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。
３、黄色反应 （1)原理
含有苯环的氨基酸,如酪氨酸、色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
反应式如下
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以呈黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。
（2）试剂
①鸡蛋清溶液(将新鲜鸡蛋清用６层纱布过滤,然后按鸡蛋清：水=1:２0配制而成。
②大豆提取液:将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。
③头发。
④指甲。
⑤0.5％苯酚溶液。
⑥浓硝酸。
⑦0．３%色氨酸溶液。
⑧０．3％酪氨酸溶液。
⑨10%氢氧化钠溶液。
(3）操作
向７个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性,观察颜 色变化(1 ~4管可能需要加热）。
4、考马斯亮蓝反应 (１)原理
考马斯亮蓝G ２５０（R ２50)具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中,其以游离态存在呈棕红色;当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
HO
+
HNO 3HO
NO 2
N O -
Na +
O
硝基酚（黄色）
邻硝醌酸钠（橙黄色）
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快,约在2分钟左右时间达到平衡,在室温一小时内稳定。
在0．０1 ~１．０mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595ｎm值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
(2)试剂
①蛋白质溶液（鸡蛋清：水＝1：２0配制而成）。
②考马斯亮蓝溶液:考马斯亮蓝G２50100mg溶于50mL95%乙醇中，加10０mL８5%磷酸混匀,配成原液。
临用前取原液15ｍL,加蒸馏水至１0０mL,用粗滤纸过滤后,最终浓度为0.01%。
（3）操作
取两支试管,按下表操作
结果分析：要分析结果,为什么出现这样的结果，什么原因导致的?
实验报告不能用铅笔写。