细胞培养基本方法
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
细胞工程--C3 细胞培养的基本方法
无菌操作技术
5. 实验中的操作要求：进行培养时，动作要准备敏捷， 但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用 受触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取 备用品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理 的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手 用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一 定的顺序，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露于 空气中。同时，培养液在未用前，不要过早开瓶；打开 的瓶口要顺风斜放在支架上或远处；试剂用过之后如不 在重复使用，应立即封闭瓶口，因直立可增加落菌机会。
定期检查下列项目:
• CO2钢瓶内的CO2压力; • CO2培养箱内的CO2浓度,温度,及水盘是否有污
染;
• 无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外 灯管及HEPA过滤器滤膜,预滤网（300小时/预 滤网,3000小时/HEPA).
相差显微镜观察 培养细胞的观察
相差显微镜的工作原理及应用
无菌操作技术
3. 洗手和着装：在利用超净工作台时，因整个前臂 要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操 作前用肥皂洗手，再用75%酒精擦拭。
洗手和着装
作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套 后才进行实验.
对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心, 并选择适当等级的无菌操作台(至少两级).
只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细 胞生长变化的实验中应用。
在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长 曲线的测定是最为基本的指标。
细胞分裂指数
细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的 百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般要计 算和观察1000个细胞中的细胞分裂相数。
细胞贴壁率
无菌培养操作
细胞培养基本方法
细胞培养基本方法细胞培养是研究细胞生物学和生物医学的重要方法之一、它可以提供一种控制环境，使细胞能够在体外生长、分化和繁殖。
细胞培养基本方法包括细胞的分离、培养基的制备、细胞的培养和细胞的传代等。
一、细胞的分离细胞的分离是细胞培养的第一步，主要目的是将组织和器官中的细胞分散为单个细胞，以便于后续的培养。
常用的细胞分离方法有机械分离、酶分离和胶粒分离等。
其中，酶分离是最常用的方法之一，通过酶的作用使细胞间的粘附分子断裂，从而实现细胞的分离。
二、培养基的制备培养基是细胞在体外生长和繁殖所需的营养物质和环境因子的混合物。
培养基的制备包括基本培养基的配制和添加适当的添加剂。
基本培养基主要由无菌的培养基基础及其所需的生长因子、氨基酸、维生素、微量元素、酶和抗生素等组成。
添加剂主要包括胎牛血清、酶抑制剂和缓冲剂等。
根据不同的细胞类型和培养需求，可选择不同的培养基配方以满足特定的培养条件。
三、细胞的培养细胞的培养是将其在无菌条件下放入培养基中，在恒定的温度、湿度和二氧化碳浓度下，利用细胞自身的增殖和分化能力，使细胞在体外生长和繁殖。
培养细胞前需要对细胞进行处理，如选择合适的培养容器和分配密度，以及消毒培养器具等。
之后，将细胞悬浮液加入培养基中，放入恒温培养箱中培养。
培养过程中需要对培养基的温度、pH值和营养物质的浓度等进行控制和调节，以保证细胞的正常生长和繁殖。
四、细胞的传代细胞在培养过程中会不断地增殖和分化，但当细胞达到一定密度或生长状态改变时，需要进行细胞的传代。
细胞的传代是指将已培养的细胞重新分离并接种到新的培养基中，以保持细胞的活性和增殖能力。
传代过程中需要注意细胞的分离方法、传代倍数和传代间隔，避免对细胞产生不良影响。
除了以上基本方法外，细胞培养还包括细胞补充和细胞冻存等技术。
细胞补充是指将培养中的细胞重新接种到新的培养器中，以扩大培养量或维持细胞的活性。
细胞冻存是将培养中的细胞经处理后储存在液氮中，可以长期保存和传递细胞。
动物细胞培养的方法
动物细胞培养的方法
动物细胞培养是一种在实验室中进行的细胞生物学技术，可以用来研究细胞的生长、分化、代谢以及毒性等方面。
一般来说，动物细胞培养需要以下步骤：
1. 选择细胞系：选择适合自己研究的细胞系，例如常用的HeLa 细胞、293细胞等。
2. 培养基配制：根据细胞系的需求配制适当的培养基，添加必要的营养物质和能量补给。
3. 细胞分离：用消化酶将组织细胞分离成单个细胞，避免细胞间黏连。
4. 细胞传代：当细胞密度达到一定量级后，需要将细胞传到新的培养皿中，以保证细胞的生长和繁殖。
5. 细胞存储：将细胞冷冻保存以备日后使用。
以上是动物细胞培养的基本步骤，当然在实际应用中还涉及到一些技术细节和技巧，需要不断摸索和实践。
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植物细胞培养的基本过程和方法
植物细胞培养的基本过程和方法植物细胞培养是一种将植物细胞体外培养的技术，其主要目的是为了研究细胞的生理、生化过程以及植物的生长发育等方面的问题，也可以用于植物遗传改良、利用细胞培养生产植物品种等领域。
下面将对植物细胞培养的基本过程和方法进行详细介绍。
1.材料准备：选择合适的植物组织作为培养材料，如茎段、叶片、根尖等。
同时还需要准备一些基本的实验仪器和培养基成分。
2.细胞分离：将选取的植物组织进行表皮剥离、细胞壁酶解等操作，将细胞分离出来。
可以使用显微镜观察细胞的分离程度。
3.培养基配制：根据不同的培养目的和植物类型，调配适合的培养基。
培养基通常包括无机盐、有机物、维生素、激素等成分，用于提供细胞生长所需的养分。
4.细胞培养：将分离得到的细胞悬浮在培养基中，将其培养在恒温恒湿的培养箱中。
培养箱中的温度和光照条件可以根据植物的特性进行调节。
5.观察和保存：定期观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、分裂情况等。
同时可以进行细胞生长速率、物质代谢等方面的研究。
对于需要保存的细胞，可以使用液氮冷冻或低温贮藏的方法保存。
1.组织培养：将植物组织培养在含有适当激素的培养基上，促使其分化和增殖。
常用的组织培养方法包括愈伤组织培养、种子发芽培养、胚培养等。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在培养基中形成悬浮细胞。
可以利用悬浮细胞进行物质代谢、遗传变异等研究。
3.离体培养：将完整的植物器官（如茎尖、叶片等）切分成适当大小的组织块，培养在含有激素的培养基上，使其分化为根、茎、叶等组织。
4.离体器官培养：将完整的植物器官（如拟南芥的花蕾、水稻的胚等）取出，培养在含有细胞分裂素和植物生长素的培养基中，经过适当的处理后，可以使其分化为新的植株。
5.基因转化：将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的表型特征。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的转化、基因枪轰击法等。
总之，植物细胞培养是一种重要的实验手段和研究方法，通过培养和处理植物细胞，可以为植物生物学和生物技术研究提供重要的理论基础和实验依据。
细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞培养的基本方法-细胞分离技术细胞分离技术一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。
细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。
下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。
1. 胰蛋白酶（Trypsin）•在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。
让组织碎片沉淀，去除上清液。
重复清洗2到3次。
•将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。
加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。
•在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
•移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
•在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。
如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
•通过无菌不锈钢丝网（100〜200mm过滤，分散所有剩余组织。
计数和接种细胞，进行培养。
2. 胶原酶（Collagenase）•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片几次。
•加入胶原酶（50〜200单位/ml，溶解在HBSS中）。
•在37C孵育4到18小时。
加入3mM CaCI2增加解离效率。
•通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。
如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
•通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
•再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3. Dis pase•用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。
•加入Dispase （0.6〜2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液）•在37C孵育20分钟到几个小时。
细胞培养基本操作
细胞培养基本操作细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。
细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。
取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。
取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。
水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。
整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。
注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。
然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。
二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。
上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。
离心：1000rpm，室温离心3min。
注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。
三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。
向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。
培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。
24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。
四、注意事项1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。
细胞培养方法
细胞培养方法细胞培养是生物学实验中常用的一项技术，它可以使细胞在人工环境中生长、繁殖和维持其生理功能。
细胞培养方法的选择对于细胞的生长和实验结果至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法。
1. 细胞培养基的选择。
细胞培养基是细胞培养的基础，不同类型的细胞需要不同种类的培养基。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，选择合适的培养基对于细胞的生长和实验结果至关重要。
2. 细胞传代。
细胞在培养过程中会不断增殖，当细胞密度达到一定程度时需要进行传代。
传代的目的是保持细胞的生长状态，避免细胞过度密集导致细胞死亡。
传代的方法包括胰蛋白酶消化、离心、重新接种等步骤。
3. 细胞培养的条件控制。
细胞在培养过程中需要适宜的环境条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常情况下，细胞培养箱是细胞培养的最佳环境，它能够提供恒定的温度、湿度和CO2浓度。
4. 消毒和无菌操作。
在细胞培养过程中，消毒和无菌操作至关重要。
细胞培养器皿、培养基、工具等都需要进行严格的消毒处理，以避免细菌和真菌的污染对细胞培养的影响。
5. 细胞培养的细胞密度控制。
细胞密度的控制对于细胞培养至关重要。
过高的细胞密度会导致细胞之间的竞争和相互抑制，从而影响细胞的生长和实验结果。
因此，需要根据细胞类型和实验要求来控制细胞的密度。
6. 细胞培养的细胞凋亡检测。
在细胞培养过程中，细胞凋亡是一个常见的现象。
因此，需要对细胞进行凋亡检测，以保证实验结果的准确性。
常用的凋亡检测方法包括Annexin V/PI双染和TUNEL染色等。
7. 细胞培养的细胞培养器具和试剂的选择。
在进行细胞培养实验时，选择合适的细胞培养器具和试剂也是非常重要的。
比如细胞培养皿、细胞培养瓶、移液器、吸头等实验器具，以及培养基、胰蛋白酶、抗生素等试剂的选择都会直接影响到细胞培养的效果。
综上所述，细胞培养是生物学实验中不可或缺的一项技术，选择合适的培养基、控制细胞密度、细胞凋亡检测等都是保证细胞培养效果的关键。
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1.操作台基本要求：
2. 随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。
3.细胞污染：
（1）细菌污染
（2）酵母污染
（3）霉菌污染
初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。
（4）病毒污染
一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。
（5）支原体污染
唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影
4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出
5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基
7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4；
成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7）
Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳
昆虫细胞在27℃为最佳
禽类细胞在38.5℃最佳
冷血动物（15℃-26℃）
9.动物细胞形态划分：
●成纤维细胞，贴附生长
●上皮样细胞呈多角形，贴附
●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附
●特殊形态：
✧I型有长突触
✧Ⅱ型没有轴突
10.细胞增长模式
11.何时传代？
●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（）
0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4
12．贴壁细胞的解离
13.贴壁细胞的传代
14.贴壁昆虫细胞传代：
15.悬浮细胞传代流程
16.细胞冻存：
17.冷冻细胞解冻方案：
18.利用血球计数器进行细胞计数：
19.台盼蓝拒染法：。