07埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定
沙门氏菌和志贺氏菌的检测(共57张PPT)
生物学特性
1.形态
两端钝圆的革兰氏阴 性杆菌，〔0.4-0.9〕 µm ×(1-3)µm，无芽 孢，周生鞭毛，一般无 荚膜，少数有包膜。
光滑型的细菌大小均
培养和生化反响
• 兼性厌氧，最适生长温度35～37℃，最适生长 PH为6.8～7.8.本菌属对营养的要求不高，在普 通营养琼脂上生长的菌落为圆形、光滑、湿润， 半透明，边缘整齐的菌落，有时可出现粗糙型的 菌落。在肠道选择性培养基上菌落小至中等，透 明或半透明，乳糖不发酵，与志贺菌的菌落相似 ，有些能产生硫化氢的菌株，在SS琼脂上形成 中心黑色的菌落。
检验方法
• 别离培养 常规的肠道选择鉴别培养基能有效地别离 沙门菌。常用肠道鉴别培养基〔MAC或EMB〕和选 择培养基〔SS等〕，强选择性培养基〔孔雀绿和亚硫 酸铋等〕仅适用范围于爆发流行时。
别离培养
〔1〕血液和骨髓：血液5ml或骨髓液 0.5ml胆汁葡萄糖肉汤或胰化蛋白大豆肉 汤中，35-37℃孵育，假设有生长〔多 在2~4日内出现〕那么移种至血琼脂平 板和SS培养基中。
V-W变异：是指沙门菌失去Vi抗原的变异。初次别离得到的具有Vi 抗原、O抗原不凝集的沙门菌称V型菌；Vi抗原局部丧失，与O抗原 血清发生凝集又可与Vi抗血清凝集者称VW型菌。 Vi抗原完全丧失 ，与O抗原血清发生凝集又与Vi抗血清不凝集者称W型菌。V-W变 异的过程是V型菌经人工培养，逐渐丧失局部Vi抗原而成为VW型， 进而丧失全部Vi抗原而成为W型菌。
2〕食物中毒〔急性胃肠炎〕：由鼠伤寒沙门菌、 猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌引起，有发热、恶心呕吐 、水样泻，严重者致脱水、休克、肾衰而死亡〔主见 于婴儿、老人等〕，但，大多2~3天自愈。
3〕败血症 ：常由猪霍乱沙门菌、丙型副伤寒沙 门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等引起。有高热 、寒战、贫血等严重病症。多见于儿童及免疫力低 下者。
志贺氏菌的鉴定要点
志贺氏菌的鉴定要点志贺氏菌（Salmonella typhi）是引起伤寒病的致病菌，其鉴定对于诊断和防控伤寒病具有重要意义。
下面我们将从菌落特征、生物化学反应、免疫学方法等几个方面介绍志贺氏菌的鉴定要点。
一、菌落特征志贺氏菌的菌落形态多样，但一般具有以下特征：1. 形态：菌落呈圆形或不规则形状，边缘整齐或呈波浪状。
2. 颜色：菌落表面呈乳白色、灰白色或淡黄色。
3. 粘液性：菌落表面有时出现透明的粘液层。
4. 反射性：菌落表面有时呈金属光泽。
5. 直径：菌落直径一般为2-3毫米，但也有较大的菌落。
二、生物化学反应志贺氏菌的生物化学反应是鉴定的重要依据之一，常用的方法包括氧化/发酵反应、代谢产物反应、酶反应等。
1. 氧化/发酵反应：志贺氏菌能利用葡萄糖产生酸和气体，而不能利用乳糖产生酸和气体，这是其与大肠杆菌等其他肠道细菌的区别之一。
2. 代谢产物反应：志贺氏菌在代谢过程中产生一些特殊的代谢产物，如硫化氢和尿素酶等。
3. 酶反应：志贺氏菌具有一些特定的酶活性，如葡萄糖酶、麦芽糖酶和内切酶等。
三、免疫学方法免疫学方法是志贺氏菌鉴定的重要手段，包括血清学方法和分子生物学方法。
1. 血清学方法：通过检测志贺氏菌特异性抗原和抗体的反应来鉴定菌株。
常用的方法有血清凝集试验、血清中和试验和酶联免疫吸附试验等。
2. 分子生物学方法：利用PCR技术检测志贺氏菌的特异性基因序列，如vi抗原基因和fliC基因等。
除了上述的菌落特征、生物化学反应和免疫学方法，还有一些其他的鉴定要点需要注意：1. 样品的处理：鉴定志贺氏菌需要注意样品的采集和保存，避免污染和细菌数量的剧烈变化。
2. 培养基的选择：选择适宜的培养基，如MacConkey琼脂和XLD琼脂等，以利于志贺氏菌的生长和鉴定。
3. 防止交叉反应：志贺氏菌与其他细菌在某些生物化学反应上存在交叉反应，需要进行鉴别。
4. 结合多种方法：综合应用不同的鉴定方法可以提高鉴定的准确性和可靠性。
志贺氏菌检测
C群：也称鲍氏菌群，有15个血清型，分解甘 露醇，无鸟氨酸脱羧酶。各型内无交叉凝集。 D群：也称宋内氏菌群，仅有一个血清型。分 解甘露醇，有鸟氨酸脱羧酶，迟缓发酵乳糖。 有Ⅰ(S相光滑菌落)、Ⅱ相(R粗糙菌落)之分。
福氏志贺菌在HE琼脂平板上的菌落 特征蓝绿色大肠埃希菌红色较大
二、志贺氏菌的生物学特性
菌落形态学
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、 质地等等，都是区分细菌的重要手段。
福 氏 志 贺 氏 菌 的 菌 落 特 征
宋内志贺菌乳糖迟发酵菌株 在麦康凯平板上的菌落特征
细菌在肉汤培养基中的生长
均匀浑浊生长是什么意思？
二、志贺氏菌的生物学特性
3、志贺氏菌的生化特性： 本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大 多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。 靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴 性，不分解尿素，不产生H2S。与肠杆菌科 各属细菌相比较，志贺氏菌的主要鉴别特 征为不运动，对各种糖的利用能力较差， 并且在含糖的培养基内一般不形成可见气 体。根据生化反应可进行初步分类。
志贺氏菌属的四个群
根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本 属细菌分为四个群、39个血清型（包括亚型） A群：也称志贺氏菌群，有10个血清型。不发酵甘露 醇，无鸟氨酸脱羧酶，与其他各群细菌无血清学 联系。 B群：也称福氏菌群，已有13个血清型（包括亚型和 变种）。最近又发现3个亚型（1c、4c、5b）。发 酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂， 各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原， 即型特异性抗原和群抗原，前者只存在于同型菌 株中，后者有许多种，存在于福氏各菌型中。例 如福氏1b型除含有1型特异性抗原外，尚含有4、6 群抗原。
二、志贺氏菌的生物学特性
志贺氏菌的检验
免疫性：病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。
四、志贺氏菌的检验
1、增菌 称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL 广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎 1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻 璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8h。 培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混 浊时即应中止培养。 2、分离和初步生化试验 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平 板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝 琼脂平板各1个，于36℃培养18～24h。 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖 的菌落。
麦康凯琼脂平板
EMB平板照片及原理
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多 挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24h，分别观察结果。
动力试验
三糖铁（TSI）琼脂试 验的原理
1. Pseudomonas aeruginosa：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile
3、血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。 先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的 存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查； 如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分 别试验。 如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检 查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先 用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果， 依次选用型因子血清检查。 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价 1、2、3分别检查，并进一步用1～18各型因子血清检查。 如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多 价血清及各型因子血清检查。
各类细菌的分类鉴定
④V~W变异：失去全部Vi抗原的变异。
变形 杆菌 属
G-b
有周身鞭 毛（摩根 菌属的部 分菌株在 30℃以上 不形成鞭 毛） 无芽孢 无荚膜
营养琼脂和血琼脂平板：迁徙扩散生 长（普通变形和奇异变形），可被0.1% 苯酚、4%硼酸、5%~6%琼脂及同型血清 或胆盐所抑制。普罗威登斯菌和摩根 菌属无迁徙生长现象。
H2O2（+）；多数致病性葡萄球菌能分 解甘露醇产酸、液化明胶和产生血浆 凝固酶。
①蛋白抗原：SPA蛋白 （存在于葡萄球菌表 面，结合在细胞壁的黏 肽部分，具有抗吞噬作 用），有种属特异性。
②多糖抗原：有型特异 性。
1.侵袭性疾病：①皮肤及软组织感 染（毛囊炎、疖、痈）；②全身性 感染（败血症、心内膜炎）；③呼 吸道感染；④医院内感染
伯菌
属
G-b
无鞭毛 无芽孢 有荚膜
血平板：圆形，凸起，灰白色，不溶血的菌 落。有时菌落呈黏液性，用接种环挑取时呈 长丝状。
肠道选择培养基：乳糖产酸菌落。
液体培养基：浑浊生长，可形成菌膜与黏性 沉淀物。
糖类发酵：发酵乳糖；h2o2（+）；脲酶（+）；OX（-）；鸟氨酸（-）；动力（-）。
本菌对氨苄西林天然耐药。 对产ESBLs菌株的治疗可用 碳青酶烯类、B-内酰胺类抗 生素/酶抑制剂或头孢菌素 类进行治疗。
糖类发酵：发酵乳糖；
OX（-）；DNA酶（-）；
^夫
尼亚
菌属
G-b
无荚膜 无芽孢 有周鞭毛
糖类发酵：发酵葡萄糖产酸产气； 可利用枸橼酸盐、乙酸盐和丙二酸 盐作为唯一碳源；
H2S（-）；山梨醇（-）；DNA酶（-）；赖氨酸（ +）；
埃希菌、志贺菌属
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防治原则
• 疫苗免疫预防已在畜牧业领域中开展了 广泛研究
• 大肠埃希菌很多菌株都已获得耐一种或 几种抗生素的质粒，耐药性非常普遍。 进行药敏试验。
• 治疗可选用庆大霉素、丁胺卡那霉素等
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志贺菌属 （Shigella）
• 形态染色
– G-杆菌 –宽0.5-0.7 µm 长2-
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）
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▪抵抗力
➢对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟 或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活
➢在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的 粪便中存活更久 ➢对煌绿、胆盐敏感。作为肠道致病菌分离培养基中 的抑制剂
➢对漂白粉、氯敏感。作为饮水消毒剂
• 内毒素------肠壁植物神经------肠蠕动失调、 痉挛------腹痛、腹泻、里急后重
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• 所致疾病
– 菌痢
• 传染源：患者和带菌者
• 传播途径：粪-口 • 表现：
潜伏期数小时至7天 发热、腹痛、腹泻、里急后重、粘液脓血便
• 免疫性
– 免疫期短，不稳固
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（3）微生物学检查及 血清学诊断
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肠道感染细菌
一、共性
1、均为革兰阴性，形态相类似的杆菌 2、无荚膜、芽胞，除痢疾杆菌外都有鞭毛，能运动
3、营养要求不高，抵抗力不强
4、生化反应活泼，能分解多种糖
5、抗原构造复杂
6、大多都以内毒素致病，引起的疾病多样化
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埃希菌属
Escherichia
志贺氏菌检测技术和鉴定要求
生化特性
能分解葡萄糖，产酸不产气（福氏6型和鲍氏 13、14型的部分菌株会产生少量气体）。大 多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。 靛基质产生不定，甲基红阳性，氧化酶、VP 试验均阴性，不产生H2S和尿素酶。根据生化 反应可进行初步分类。
常以甘露醇和乳糖发酵特性来区分志贺菌的生化群
常以甘露醇和乳糖发酵特性来区分志贺菌的生化群
A群：痢疾志贺菌，甘露醇、乳糖、棉子糖及鸟氨 酸脱羧酶均阴性。
B群：福氏志贺菌，棉子糖和甘露醇阳性（其 中4、 6型常见甘露醇阴性的变种），乳糖及鸟氨酸 脱羧酶阴性。
C群：鲍氏志贺菌，甘露醇阳性，乳糖、棉子糖及 鸟氨酸脱羧酶（除13型）均阴性。
D群：宋内氏菌，甘露醇和乳糖（迟缓）阳性，鸟 氨酸脱羧酶阳性。
血液:
当怀疑为菌血症时，静脉采集5~10ml血液， 按1:10比例加入血增菌培养液中进行培养。
其他标本:
疑似痢疾爆发疫情病原学检测时
➢ 外环境样本可采集患者的污染衣物、剩饭菜、可 疑食品、抹布、污水、井水等，采集的标本应立 即按1：10的比例接种GN增菌肉汤，置37℃增菌 6～8h。
➢ 媒介昆虫如苍蝇类，用消毒蝇拍拍打10~15只/份, 装入9mlGN增菌肉汤中，尽快送实验室，置37℃增 菌4～6h。
志贺菌属抗原分类
血清分类
菌名 群
型
亚型
志贺菌 A 1～12
生化特性
甘露醇 鸟氨酸 脱羧酶
—
—
福氏菌 B 1～6,X、y 1a,1b,1c,2a,2b,3a,3b,
变种
3c,4,4a,4b,4c,5a,5b
+
—
鲍氏菌 C 1～18
+
—
宋内菌 D
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和
中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体检验方法Mic伪biological examination of food hygi叨ewe Examination of Salmonellae , Shigellae , and diarrhoea causative 及cherich血coli妙means of thed泣agnostic typing phage set for enterobacteriaceae前言本标准对GB/T4789.31一1994袭食品卫生微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌肠杆菌科噬菌体检验方法》进行修订。
本标准与GB/T4789.31一19料相比主要修改如下：―按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式和文字进行修改。
―规范原标准中的“设备和材料”。
本标准自实施之日起，GB/T4789.31一19944同时废止。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。
本标准起草单位：江西省卫生防疫站、中国疚病预防控制中心营养与食品安全所。
本标准主要起草人：何晓青、付萍、计融。
本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。
范围本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的基本要求、操作程序和结果判定本标准适用于各种食品、食物中毒的检验，也适用于食品从业人员的肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验．2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其墩新版本适用于本标准。
沙门菌属和志贺菌属检验
(1)原理：用已知的伤寒沙门菌O、H抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原(PA、PB)与肠热症患者血清做定量试管凝集试验，以出现“2+”凝集的最高血清稀释度为效价，测定相应抗体含量，用以辅助诊断肠热症。
(2)试验方法：为单管稀释法。准备4排小试管，每排7支并标记，另取中号试管1支，加生理盐水3．8ml及被检血清O．2ml，混匀，即为1：20稀释，总量为4ml。然后取出2ml按每管0.5m1分别放人各排小试管中的第1支试管中。再于上述中号试管内加生理盐水2ml混匀，此种血清即为1：40稀释，吸取此稀释度血清2ml，按每管0.5m1分别加到各排小试管中的第2支试管中。以此类推连续稀释到各排小试管第6支试管为止，第7支小试管只加入0.5ml生理盐水做阴性对照。然后按表2-5操作。
注意事项
1．加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加O．5ml。
2.结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从管底升起，最后按液体的清浊，凝块的大小进行记录，对照管(不凝集)与试验管同时对着光线往暗处看液体透明度和凝集块。
3.“H”凝集呈絮状，以疏松之大团铺于管底，轻摇试管即能荡起，而且极易散开。
结果判断、解释和报告：
①分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。
②经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出××志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离出××志贺菌×型”。
(2)沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。首先选用A～F组多价“O”诊断血清做玻片凝集试验。在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在5～10min内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验。若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，加热100℃、30min，再与A～F组多价“O”诊断血清做凝集试验。若与A～F组多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检出率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。
志贺氏菌属和埃希氏菌属
四、 防治
1.控制消灭传染源，切断传播途径。 2.特异性预防：注射伤寒、甲乙副伤 寒三联菌苗预防，但副作用大，口 服活菌苗在试用阶段。 3.用抗生素治疗,但停药过早容易复发。
2.抗原构造：有O、H、Vi抗原和菌毛抗原。 （1）菌体抗原（O）：LPS， 耐100℃数小 时。为分组的依据，A-E组对人致病， 刺激机体产生IgM抗体。 (2)鞭毛抗原（H）：为蛋白质，65℃10 分钟破坏，为分型依据，H抗原刺激机 体产生IgG抗体。 (3)毒力抗原（Vi）：少数新分离的菌株 有Vi抗原，有抗吞噬作用。
二.致病性和免疫性
致病物质：侵袭力与O 抗原、Vi抗原有
关，内毒素为其主要致病物质。
所致疾病:
1.肠热症（typhoid fever）：即伤寒、副 伤寒,由s.typhi or S.paratyphi引起。消化 道感染，传染源是病人、带菌者。
免疫性：肠热症后可获牢固免疫力。细胞内寄
生菌，主要是细胞免疫。 2．急性胃肠或食物中毒 由鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍 乱沙门氏菌引起，产生肠毒素致病。 3．沙门氏菌菌血症 多由猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏 菌引起 。
第十章 肠道杆菌
肠道病原菌 经消化道感染的病原菌包括:肠 杆菌科细菌、弧菌属、幽门螺杆菌、 空肠弯曲菌等。 肠杆菌科共14个属，对人有致病 作用的主要是沙门氏菌属、志贺氏 菌属和埃希氏菌属。
第一节大肠埃希氏菌
Escherichia coli (E.coli)
一、生物学性状： 1.分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖 类，在EMB培养基上呈紫黑色菌落。 2.抗原构造：用O抗原分群（170群）, 用H抗原、K抗原分型。血清型表示法： O：K：H ，如O157:H7。
二、致病性
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埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定
一、目的对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系；（4）进行学术交流。
二、原理
根据肠杆菌科的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等
将肠杆菌科由属鉴定到具体种类。
三、标本
不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、
血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。
四、试剂及器材
革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、标准血清、玻片、接种针（环）、酒精灯等。
五、鉴定程序
埃希菌属、沙门菌属、志贺氏菌属鉴定
标本增菌培养
分离培养（SS、麦康凯）
观察生长情况，挑可疑菌落
革兰氏染色镜检：G—杆菌，氧化酶（—）纯培养（转种克氏双糖铁培养基）及做动力、靛基
质、尿素、MIU
肠杆菌生化编码管
据结果初步报告
血清学凝集试验（多价、单价进一步定属、分型）
确定报告
六、临床意义
1、大肠埃希氏菌在肠道可分为致病性与非致病性，非致病性菌作为正常菌群存在，致病菌引起腹泻。
肠道作为致病菌外引起其他感染。
2、沙门菌可引起伤寒和副伤寒、败血症、食物中毒、肠炎等。
3、志贺氏菌多侵犯肠道引起菌痢。
七、全防护措施
在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼
罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实
验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。
八、标本处理
废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。
九、参考文献
诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。