大鼠长期毒性试验质量控制探讨

(1.FacultyofLaboratoryAnimalScience, TongjiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan430030, China;
2.DepartmentofPharmacology, TongjiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wuhan430030, China)
【Abstract】 Howtocontrolthequalityoflong-term toxicitytestonratsisveryimportant.Itincludesthequality controlbeforeandduringandaftertheexperiment.Thekeythingisdose-designing, whilethecoreispracticingaccording tothegoodlaboratorypracticeandthestandardoperatingprocedure, themostimportantanddifficultistocontrolthe qualityofdata-analysisandreport.
中国比较医学杂志 2010年 1月第 20 卷第 1期 ChinJCompMed, January2010, Vol.20.No.1
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2.5 血液学血象 、血生化指标的检查 红细胞计数 (RBC)、血红蛋白量 (Hb)、白细胞计
数和分类 (WBC+DC)、血小板计数 (BPC)是血液学 检测的内容 , 天门冬氨酸氨基转换酶 (AST)、丙氨酸 氨基转换酶 (ALT)、碱性磷酸酶 (ALP)、总蛋白 (TP)、 白蛋白 (ALB)、总 胆固 醇 (T-CHO)、总 胆红 素 (TBIL)、空腹血糖 (GLU)、尿素氮 (BUN)和肌酐 (Crea) 是血生化检测的内容 。分别于给药 3个月 (13周 )、6 个月 (26周 )和停药后 4周进行采血检测 。检测中所 需标本分别是全血和血清 , 采用血球自动分析仪和全 自动生化分析仪进行测定 。测定结果的客观性与动 物全血样本是否凝血和血清样本是否溶血有关 。 重 点是改进采血方法 , 提倡动物麻醉后摘眼球采血和腋 动脉采血法[ 5] , 及时送检 。注意动物编号和采血管号 的一一对应 , 做好记录 , 防止出错 。 2.6 大体解剖及脏器称重 、取材 、固定待检等
(1.华中科技大学同济医学院实验动物学部 , 武汉 430030;2.华中 科技大学同济医学院药理学系 , 武汉 430030)
【摘要 】 大鼠长期毒性试验是费时长 、参加人员多 、消耗财力和 物质大 、操作繁琐复杂而又经不起重 复的一个 高难度研究工作 , 对其进行质量控制显得尤为重要 。 主要 包括试 验开始 前的试 验设计 质量控 制 、试 验过程 中的全 程质量控制和试验结束 后的资料整理和实验报告质量控制 。
1 试验设计质量控制
试验设计是进行试验和统计分析的先决条件 , 是试验研究获得预期结果的重要保证 。 长期毒性试 验往往需要参考急性毒性 、一般药理 、药代动力学研 究和短期重复给药试验结果等进行合理设计 。试验
[ 作者简介 ] 许迪(1967 -), 男 , 医学硕士 , 工程师 , 主要从事动物实验及其管理 。 E-mail:xudi676996@
选用标准化的实验动物 , 从有生产许可证单位 购进健康合格动物 , 观察适应一周 , 剔除体质过弱者 和体重过大或过小者 。 饲养在有使用许可证单位提 供的标准化实验设施内 , 保障设施的正常运转 , 提供 实验动物所需要的舒适环境条件和足够的全价平衡 营养 , 自由采食和饮水 , 每周更换两次垫料 , 保证实 验动物的质量 。对动物实验屏障设施进行制度化 、 规范化 、素质化管 理[ 4] , 是确保 动物实验顺利 进行 的重要保证 。 2.2 实验动物的分组与编号
按照 《新药审批办法 》, 主要包括一般指标 (体 重 、采食量 、行为 、死亡等 )、血液学 、血生化 、脏器重 量 、大体解剖及毒理病理学检查 。 1.5 数据处理及结果分析
长期毒性试验中定量数据均用 x±s表示 , 要用 国际单位 。 不仅要进行各组两两之间的比较 , 还要 说明给药组之间的比较 , 以说明量 ———毒关系 。对 于符合正态分布的数据资料 , 可用 T检验或方差分 析 , 如果是非正态分布 , 则用非参数统计分析法 。
【关键词 】 长期毒性试验 ;质量控制 ;大鼠 【中图分类号 】R-332 【文献标识码 】A 【文 章编号 】1671-7856(2010)01-0061-03
QualityControlofLong-term ToxicityTestonRat
XUDi1, KONGLi-jia1 , DUZuo-hua2 , ZHOUShun-chang1, YEMing-xia1 , XIONGMei-yun1
长期毒性试验是临床前毒性评价的主要内容 , 是新药审评重点内容之一 , 是能否过渡到临床试用
的主要依据 。 另外 , 它为临床安全用药的剂量设计 提供参考依据 , 为临床毒副反应的监护及生理生化 指标检测提供依据 。 因此 , 必须对长期毒性试验进 行质量控制 。 主要包括试验开始前的试验设计质量 控制 、试验过程中的全程质量控制和试验结束后的 资料整理和实验报告质量控制 。
首先要设计好批量动物尸检记录表格 , 包括动 物种类和实验内容 、活体及解剖时间 、实验方法和分 组 、动物编号与病理编号 、动物性别和体重 、解剖所 见 、脏器重量 、送检单位和送检者 、解剖者和解剖日 期 。其次按照先对照组后实验组的顺序 , 采用急性 失血法处死动物 , 做全身体表检查 , 然后按先腹腔后 胸腔 , 再脑脊髓 、外周神经 、骨髓 、体腔外特殊部位 、 注射部位 、皮肤和肌肉等解剖取材 , 防止遗漏 。 其中 胸腺 、胰腺 、肾上腺 、卵巢 、甲状腺 、垂体 、脊髓等腺体 组织或微小组织应使用沙布或擦镜纸非挤压式包裹 置于 10%甲醛溶液中 , 防止包 埋时混淆和丢失 , 保 证病理学检查中组织样 本数目的完整 性[ 6] 。 怀疑 毒性作用的靶器官要多取材 , 主要脏器和可疑损伤 部位必须留有补做标本 。 取病变部位时应有足够的 正常组织连带 , 有利于对比观察 。 要求样本均取自 该组织的代表区 。 基本原则是分部位专人专责 , 专 人称量 , 专人进行组织固定 。
【Keywords】 Long-termtoxicitytest;Qualitycontrol;Rat
长期毒性试验可以观察连续反复给药时 , 实验 动物出现的毒性反应 、剂量与毒性效应的关系 、主要 毒性靶器官 、毒性反应的性质和程度 、毒性反应是否 可逆等 ;还可观察在连续反 复给药时 , 动物的耐受 量 、无毒反应剂量 、毒性反应剂量及安全范围 ;并可 了解毒性产生时间 、达峰时间 、持续时间及可能反复 产生毒性反应的时间 , 有无迟发性毒性反应 、有无蓄 积毒性或耐受性等 [ 1] 。 这充分说明长 期毒性试验 在临床前安全性评价中的重要地位 , 对于新药研究 010年 1 月第 20卷第 1 期 ChinJCompMed, January2010, Vol.20.No.1
设计应由富有经验的药物毒理学家和药理学家负责 把关 。 1.1 剂量设置
剂量设置科学合理是试验成功的关键 。剂量设 计的方法有半数致死法 、药代动力学法 、最大耐受量 法 、拟用临床剂量法和等效剂量法等 [ 1] 。 尤其是后 三种方法 , 具有较高的参考价值 , 受到毒理学界的重 视 。不过 , 受试物各种各样 , 不可机械地照抄照搬 , 而应当是个案研究 , 对具体药物进行认真而细心的 预试 , 才是摸准剂量的关键 。正式试验常用三个剂 量组和一个阴性对照组 。 高剂量组应有部分动物出 现毒性反应或死亡 (不超过 20%), 目的是为寻找毒 性靶器官 、毒性反应症状及拯救措施提供依据 , 中剂 量组应使动物产生轻微的或中等程度的毒性反应 , 低剂量组应略高于药物对动物的有效剂量或临床试 验用剂量而不出现任何观察指标的异常 , 目的是为 寻找动物安全剂量范围 , 为临床剂量的设计做参考 。 1.2 动物选择
实验动物雌雄各半 , 分别按体重进行分层随机 分组 , 随机化方法可选用随机数字表 。每组 20 ～ 30 只 , 每笼单性别动物 3 ～ 5只 , 每只动物均应编号 , 用 3%苦味酸溶液标记 ;同时辅助以笼具编号 。 防止动 物逃逸 , 确保实验结果的准确可靠 。 2.3 药品的配制及给药
受试药必须符合临床试用质量标准 , 保证其稳 定性 。药品配制时 , 必须按试验设计方法认真进行 , 最好现配现用 。多采用不等浓度等容量给药 , 给药 时间要相对固定 , 由熟练的技术人员进行操作 , 减少 系统误差 。 2.4 日常观察记录
SPF级封闭群 Wistar或 SD大鼠 , 5 ～ 7周龄 , 连 续给药 6个月 时宜选用 5周 龄的大鼠 , 雌雄各半 。 动物的预订和 SPF级动物实验室的消毒准备工作 以及用于记录的统计表格要提前做好 。 1.3 药品给药方式和周期
长期毒性试验给药途径 , 要尽量模拟人类实际 接触药物的方式或途径 , 还要考虑将进行的其它毒 性实验接触的途径相一致 。主要途径包括灌胃 (经 口 )给药 、注射及皮肤接触 。 大鼠静脉注射时可用 腹腔注射代替 , 肌肉注射或皮下注射时可变换注射 部位 。 给药周期一般为临床给药周期的 3 ～ 4倍 [ 2] 。 3个月或 3个月以上每周连续给药 6 d, 以维持试验 动物血浆中或体液内有较稳定的浓度水平 , 保持药 物的生物学效应 。 1.4 观察指标
对实验动物的一般状况观察 , 虽是最古老最简 单的毒性观测方法 , 却是最重要的基本观察内容之 一 。 体重是反映机体整个情况最灵敏的指标 , 摄食 量的变化在大多数情况下与体重的变化是一致的 , 但它出现得更早 , 反应更灵敏 。 因此每天称量动物 的摄食量是非常必要的 。 每周称一次体重 , 作为计 算下周给药量的依据 。 每天要认真观察动物的神经 系统 、消化系统及运动系统的反应 , 重视对感觉器官 (眼 、耳等 )的观察 。 对于濒死和死亡动物 , 要及时 进行剖检 , 主要脏器要取材 , 固定待检 ;一时有困难 的 , 也可低温冻存 , 以免时间过久组织自溶 。 观察记 录要及时 、准确 、全面 、清楚 , 保存原始记录 , 以备日 后核查之用 。