酶的测定方法
生物化学检验中酶的测定综述
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
CK-MB
这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时
间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测 限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他 分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛 接受。 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门 的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基 因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。
由于同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不
同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等 方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的 分析和鉴定提供了理论基础。 临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精 确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶 的总活性和各同工酶组分的活性。
电泳法
在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最
CK-MB
是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测
定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度 （Mass）的方法。 CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗 CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、 FEIA等方法测定。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多
肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化 作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、 生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的 一组酶称为同工酶。 凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶， 而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶 或酶的多种形式。
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
消化酶的测定方法
消化酶的测定方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!消化酶在生物体内发挥着至关重要的作用，其测定方法的研究对于深入了解生物体内消化过程及其相关生理机制具有重要意义。
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
淀粉酶的测定方法
淀粉酶的测定方法
淀粉酶的测定方法主要有以下几种：
1. 碘遇法：将待测样品与含有淀粉的试液反应，然后加入碘溶液，观察颜色变化。
淀粉酶能催化淀粉水解产生葡萄糖，当样品中有淀粉酶存在时，反应液中淀粉的含量减少，碘反应呈现淡黄色。
通过比较反应前后颜色的变化程度，可以间接测定淀粉酶的活性。
2. 滴定法：采用淀粉为底物，测定反应液中葡萄糖的含量。
首先将待测样品加入含有淀粉的试液中，然后根据反应的程度，利用滴定法以还原糖作为指示剂测定反应液中葡萄糖的含量，从而计算淀粉酶的活性。
3. 导电度法：利用淀粉酶对淀粉的水解反应产生的葡萄糖使反应液的导电度发生变化来测定淀粉酶的活性。
测定时先将反应液的导电度测定为A，然后加入淀粉酶，反应一段时间后导电度测定为B，根据B-A的差值可以计算淀粉酶的活性。
4. 比色法：利用淀粉酶对淀粉的水解反应产生的葡萄糖与某种试剂发生比色反应，通过测定反应液的吸光度来间接测定淀粉酶的活性。
常用的比色试剂包括间苯三酚、邻苯二酚等。
需要注意的是，不同测定方法的适用范围和操作步骤可能会有所不同，具体选择
哪种方法取决于实验目的和样品特点。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶.本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑〔NBT〕在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收.而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成.于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高.据此可以计算出酶活性大小.二、材料、仪器设备与试剂〔一〕材料；水稻或小麦叶片〔二〕仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯〔反应试管处照度为4000Lx〕；5.试管或指形管数支.〔三〕试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液〔pH7.8〕；2. 130mmol/L 甲硫氨酸〔Met〕溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存.三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片〔视需要定,去叶脉〕0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml.取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液.2. 显色反应取5ml指形管〔要求透明度好〕4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂〔酶〕用量〔ml〕终浓度〔比色时〕0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min〔要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长〕.3. SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度.四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性.SOD总活性＝<A ck－A E>×V/<A ck×0.5×W×V t>上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积〔ml〕Vt测定时样品用量〔ml〕W样鲜重〔g〕蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重. SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：〔V=3ml〕磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3mlNBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：<1> 0.05mol/L PBS：pH7.8<2> 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml<3> 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml<避光保存><4> 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml<5> 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml<避光保存>注：〔1〕对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管<2> 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：〔1〕5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml〔2〕0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：〔1〕0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A<0.2mmol/L的HAc溶液>—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中〔2〕0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中〔临用前配制〕〔3〕0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml〔临用前配制〕方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液〔5min值为500-800即可〕—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：<1> 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕 <2> 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：<1>以不加H2O2的50mmol/L的PBS〔pH7.0〕为空白把A240调零<2>50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时—1min后在240nm下比色,1次/1min<连续读取5min>.20XX06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水.称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管〔做三个重复〕,加入25ml浓度为80％的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度,以80％的丙酮液为空白.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36〕也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰649Cx.c=<1000D470-2.05Ca-114Cb>/2452 抗氧化酶活性的定：〔2.5g样〕0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.8〕溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134〕. 取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液〔pH=7.8〕〔最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液.2.1丙二醛〔MDA〕的测定：20％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕；0.5% 硫代巴比妥酸〔TBA〕溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸〔TBA〕,用20％三氯乙酸〔TCA〕溶液溶解并定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕〔先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解〕；0.5ml酶液〔对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液〕〔做三个重复〕+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却〔至少30min〕――比色〔OD600、OD532、OD450〕.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕2.2超氧化物歧化酶〔SOD〕的测定：NBT<400ml>混合反应液:392mlPBS<Ph=7.8>,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液〔100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素〕.〔另配〕100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml<根>或0.02 ml<叶>粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度.2.3过氧化物酶〔POD〕的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.0〕溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml.0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS> + 0.02ml？？〔原来为0.01〕酶液〔根加0.05ml酶液〕〔对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液〕〔做三个重复〕,记录470nm处OD降低速度.将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕比色时加酶液,混合后即刻计时.2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量〔ml〕00.10.20.40.60.81.0H2O〔ml〕1.00.90.80.60.40.20冰乙酸〔ml〕2222222显色液〔ml〕3333333脯氨酸含量〔µl〕012468100.5ml酶液〔对照用0.5ml 80％乙醇代替〕〔做三个重复〕+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520.2.5可溶性蛋白的测定〔参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》〕牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml.90％乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水.？？？85％〔W/V〕磷酸：170ml磷酸+ 30ml蒸馏水.考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中,加入85％〔W/V〕磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L.常温下可保存一个月.标准曲线的制作：配制0～100µg/ml血清白蛋白血液管号123456100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.020.040.060.080.10配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液管号789101112100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.20.40.60.81.00.1ml 酶液〔做三个重复〕+ 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色.2.6过氧化氢酶〔CAT〕的测定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到500ml.1 ml 0.3%H2O2溶液+ 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定240nm处OD降低速度.将每分钟OD 减少0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕2.7 抗坏血酸〔ASA〕的测定：〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125〕5％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml.10％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml.150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液的配制：100ml.44％H3PO4溶液的配制：250ml.4％2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml.3％FeCl3溶液的配制：100ml.首先标制作准曲线.粗酶液的提取：取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入15m 5％三氯乙酸〔TCA〕溶液〔最好是较冷的三氯乙酸〔TCA〕溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸〔ASA〕含量的测定.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕测定：0.2ml 粗酶液+ 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液+ 0.2ml H2O,混匀〔振荡〕,至少30秒后,再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸〔TCA〕溶液+ 0.4 ml 44％H3PO4溶液+ 0.4 ml 4％2,2-二联吡啶溶液+ 0.2ml 3％FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕2.8 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料+ 2ml 0.3mol/L醋酸汞+ 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水〔每次10ml〕在摇动情况下冲洗2次.向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液,混匀,离心.上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗.离心后溶液与第一次离心液合并.向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/L KIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止.1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽.〔参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院##植物生理研究所编〕.2.9天冬酰胺合成酶〔AS〕的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶〔AspAT〕的测定：3 硝酸还原酶<NR>的测定采用离体法：〔1g样〕〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29〕亚硝酸钠标准溶液〔1µg/ml〕：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml.0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml.3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml.1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中.0.2％a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中.0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液.0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到1L.提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液. 2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液〔临用前配制〕. 首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液.摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色.以亚硝态氮〔μg〕为横坐标〔x〕,光密度值为纵坐标〔y〕绘标准曲线或建立回归方程.各试剂加入顺序管号1234567亚硝酸钠标准液<ml>00.20.40.81.21.62.0蒸馏水<ml>2.01.81.61.20.80.401％磺胺溶液<ml>44444440.2%α-萘胺<ml>4444444每管含NO2- <μg>00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶<NR>的测定.0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混匀〔对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替〕,在25℃水浴中保温30min.保温结束后立即加入1ml 磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.2％a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度.根据回归方程计算.。
脂肪酶的检测方法
脂肪酶的检测方法
脂肪酶是一种重要的酶类物质，它在人体内起着分解脂肪的作用。
脂肪酶的检测方法有多种，下面将介绍其中的几种常见方法。
1. 酶活力测定法
酶活力测定法是一种常见的脂肪酶检测方法。
该方法通过测定脂肪酶对底物的催化作用，来确定脂肪酶的活力。
具体操作步骤为：将待测样品与底物混合，加入适量的缓冲液，然后在一定的温度和时间下反应。
反应结束后，通过测定反应液中的产物浓度或底物消耗量来计算脂肪酶的活力。
2. 免疫学检测法
免疫学检测法是一种基于抗体与抗原相互作用的检测方法。
该方法通过检测脂肪酶在样品中的含量，来确定脂肪酶的水平。
具体操作步骤为：将待测样品与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入标记有荧光物质的二抗，使其与复合物结合。
最后通过荧光信号的强度来测定脂肪酶的含量。
3. 基因检测法
基因检测法是一种通过检测脂肪酶基因的变异来确定脂肪酶水平的方法。
该方法通过PCR扩增脂肪酶基因，然后对扩增产物进行测序，检测基因序列中的变异情况。
根据不同的基因变异类型，可以预测脂肪酶的活力水平。
总之，脂肪酶的检测方法有多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，应根据需要选择合适的方法进行检测。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN 的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL 置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
3、结果计算以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）Ure＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶的测定方法
酶是一种生物大分子，能够催化生物化学反应。
酶的测定方法有多种，如下：
1. 活性测定法
酶的活性是指每单位时间内酶所催化的反应物的转化量。
通过活性测定法可以测定酶的活性，常用的方法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。
2. 蛋白含量测定法
酶是一种蛋白质，因此可以通过测定酶的蛋白含量来间接测定酶的含量。
常用的蛋白含量测定方法包括比色法、光度法等。
3. SDS-PAGE电泳法
该方法利用SDS-PAGE电泳将酶分离出来，然后通过染色等方法测定酶的含量。
4. 免疫学方法
该方法利用酶的抗原性质，通过抗体结合酶来测定酶的含量或活性。
常用的方法包括ELISA等。
总之，不同的酶测定方法适用于不同的酶以及不同的实验目的，选择合适的方法可以提高实验的准确性和可靠性。
- 1 -。