酶检测方法
生物化学检验中酶的测定综述
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
CK-MB
这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时
间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测 限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他 分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛 接受。 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门 的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基 因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。
由于同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不
同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等 方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的 分析和鉴定提供了理论基础。 临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精 确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶 的总活性和各同工酶组分的活性。
电泳法
在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最
CK-MB
是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测
定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度 （Mass）的方法。 CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗 CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、 FEIA等方法测定。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多
肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化 作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、 生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的 一组酶称为同工酶。 凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶， 而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶 或酶的多种形式。
酶的纯度检测方法
酶的纯度检测方法一、SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，可用于检测酶的纯度和分子量。
其原理是将蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，利用SDS对蛋白质进行线性变性，使其保持负电荷，根据蛋白质的分子量和电荷，使其在凝胶中以不同速度移动，最终形成不同大小的条带，根据条带的位置可以确定目标蛋白的分子量和纯度。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，然后将混合溶液加热至95℃，使蛋白质变性，接着将样品加载到SDS-PAGE凝胶槽中，开启电源进行电泳分离，最后用染色剂染色并观察结果。
通过比较目标蛋白与其他蛋白的条带位置和强度，可以确定酶的纯度。
二、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种分子大小排除原理的层析技术，适用于检测酶的分子量和纯度。
其原理是在凝胶柱中，根据蛋白质的大小进行分级排除，较大的蛋白质会快速通过凝胶柱底部，较小的蛋白质会在凝胶柱中受到阻滞，从而实现蛋白质的分离和检测。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品加入到凝胶柱中，然后进行层析分离，最后收集各个分离后的蛋白样品，通过比较目标蛋白的峰形和大小与其他蛋白的区分度，确定目标酶的分子量和纯度。
三、亲和层析亲和层析是利用目标蛋白与配体之间的特异亲和性进行分离和检测的一种技术。
在亲和层析中，通常通过牢固地固定配体在固定基质上，然后将目标蛋白与配体结合，再通过洗涤和洗脱等步骤，最终实现目标蛋白的纯化和检测。
在实验操作中，首先在含有配体的固定基质中将待检测的酶样品加入，然后进行洗涤和洗脱过程，最终收集得到目标酶。
通过比较目标酶的产率和纯度与其他蛋白的区分度，可以确定酶的纯度。
四、离子交换层析离子交换层析是利用蛋白质在不同离子强度和pH值下的电荷性质进行分离和检测的技术。
在离子交换层析中，通常通过固定阴离子或阳离子交换基质，再根据待检测的酶的电荷性质，通过调节离子强度和pH值，实现酶的分离和检测。
在实验操作中，首先将待检测的酶样品加入到含有离子交换基质的柱中，然后通过逐步改变离子强度和pH值，逐步洗脱目标酶，并通过收集得到的分离蛋白检测目标酶的产率和纯度。
酶活力测定的原理和方法
B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
切勿反復 凍結-解凍。
酵素失活的原因
• • • • • 可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質 變性： (2) 酵素 活性區 破壞： (3) 蛋白脢 水解： (4) 酵素 抑制劑：
酶反应速度曲线
产 物 浓 度 斜率＝浓度/时间＝V 时间
酶反应速度可以通过单位时间内，单位体积中底物的减少量 或产物的增加量来表示。
酶活力的测定
• 酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。 • 必须测定酶反应的初速度。 • 底物浓度必须足够的大，至少为Km的10 倍。 • 酶浓度必须适合。
1、化学法
• 化学法是利用化学反应使产物变成一个 可用某种物理方法测定的化合物。如根 据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来 计算酶的活性。
2、放射性化学法
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
同工酶检测方法
同工酶检测方法
同工酶检测方法是一种用于确定酶活性和酶的存在性的常用实验技术。
同工酶是指具有相似化学结构但在酶活性和功能上有差异的酶。
通过检测同工酶的存在和活性，我们可以了解酶的功能差异和其在生物体内的重要作用。
同工酶检测方法主要包括以下几种：
1. 凝胶电泳法：这是最常用的同工酶检测方法之一。
通过将样品中的酶进行凝胶电泳分离，然后在凝胶上加入适当的底物和染色剂，可以观察到酶的活性带和相应的颜色变化。
根据活性带的位置和颜色变化，可以确定酶的存在和活性差异。
2. 免疫学方法：同工酶也可以通过免疫学方法进行检测。
这种方法利用特异性抗体与酶结合，形成免疫复合物，然后通过染色或荧光标记的抗体检测酶的存在和活性。
这种方法具有高灵敏度和高特异性，适用于复杂样品的检测。
3. 分子生物学方法：随着分子生物学技术的发展，同工酶的检测也可以通过PCR、测序和基因表达等方法进行。
这些方法可以直接检测目标酶基因的序列差异或转录水平的变化，从而确定不同同工酶的存在和表达差异。
除了以上常用的方法外，还有一些新兴的技术被应用于同工酶的检测，例如质谱分析、表面等离子共振和生物传感器等。
这些方法具有高灵敏度和高通量的特点，可以快速、准确地检测同工酶的存在和活性。
总之，同工酶检测方法在生物学研究和临床诊断中起着重要的作用。
不同的方法可以根据研究目的和样品类型选择使用，从而更好地了解同工酶的功能和生物学意义。
生化基础物质检测—酶活性检测
反应进程曲线（速率
时间（s）
法） 317 334 351 368 385 402
吸光度（A） 1.253 1.204 1.178 1.146 1.126 1.097
据此计算此酶的∆A/min
419 1.048
1.450
1.400
1.350
延滞期
1.300
预孵育期
终点法
1.250 1.200
速率法
线性期
指示酶
Ex
Ea
Ei
A
B
C
P
待测物质 中间产物
终产物
酶偶联反应的原理：
在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有 恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期 可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定
常用指示酶及其指示反应
1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱
反应如下：
色原物质
Trinder反应：
POD
2H2O2 + 4-AAP + 酚
醌亚胺（红色） + 2H2O
应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）
等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通 过Trinder反应加以测定
酶偶联法测定ALT的吸光度变化图
吸光度(A）
氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下 列反应：
P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定
应用：ALT、AST、CK等酶活性测定
2.过氧化物酶（POD）
植物五种酶活性检测方法
欢迎阅读选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。
1、多酚化酶（Polyphenoloxidase ，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g ）,料液比1:2，加入内含5%PVP （w/v ）经遇冷的pH 为7.2的柠檬酸-，取上取 1.2ml （（37℃恒合液。
0.01为2离心20min 取酶提取液0.2ml ，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min ，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。
PAL 的酶活性以每小时在290nm 处吸光度变化0.01OD 为一个活力单位。
3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase ，LOX )活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。
4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。
Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。
4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[取2-3ml5分ΔA470积（ml，5取（含1%PVP12h。
1000r/min离心20min,得到酶初提液。
取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。
取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。
（测定30s读数一次，5分钟）。
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
淀粉酶检测方法
淀粉酶检测方法淀粉酶是一种在生物体内分解淀粉的酶类，在工业生产中也有广泛的应用。
淀粉酶检测方法的研究和开发对于生物学和工业生产都具有重要的意义。
本文将介绍10种常用的淀粉酶检测方法，并展开详细描述。
1. 检测淀粉酶酶活力的方法淀粉酶酶活力的检测是在一定的条件下测定淀粉酶对淀粉分子链断裂的程度。
其方法多种多样，如I2-KI法、Nelson-Somogyi法、DNS法、酚硫酸法等。
其中DNS法的操作简单、精密度高、结果准确，被广泛运用于淀粉酶酶活力的测定中。
DNS法的具体流程：取淀粉酶反应液1ml，加入60μl 1% 普鲁士蓝，阴离子化的淀粉酶会将淀粉水解成低聚糖，反应后加入7.5ml DNS液，于100℃水浴烘箱加热10min，将反应液冷却至室温后用1mol/L NaOH调至中性，以1cm光程在720nm波长处测定吸光度。
2. 紫外线比色法紫外线比色法是一种测定淀粉酶酶活力的快速、准确、灵敏的方法。
该法利用酶水解淀粉时所产生的差异色团在化学性质和吸收光谱方面的变化来测定淀粉酶酶活力。
紫外线比色法的具体流程：取一定量的淀粉酶及淀粉，在相应的pH值下孵育一定的时间后，停止反应，加入氢氧化钠，合并各样品，稀释，分别于270nm、309nm处记录吸光值，然后计算各组淀粉酶的缩合作用所产生的光吸收值，即可求出淀粉酶的酶活力。
3. pH滴定法pH滴定法是以酶水解完淀粉后所生成的氢离子释放量作为反应结束的依据。
该方法的特点是操作简单，易于掌握，准确度高。
pH滴定法的具体流程：取一定量的淀粉酶及淀粉，设置相应的pH值，在一定的温度下孵育一定时间，取出样品，加入酚酞pH指示剂，并滴加NaOH溶液，直到溶液从淡红色转为深红色，记录NaOH滴加量，计算其中的氢离子产生量即可求出淀粉酶的酶活力。
4. 薄层酶法薄层酶法是将淀粉酶和淀粉均匀混合后涂在薄层板上，然后观察酶诱导的淀粉分解反应的变化，以判断淀粉酶的活力。
薄层酶法的具体流程：将淀粉酶和淀粉均匀混合后涂在薄层板上，然后孵育一段时间，用紫碱蓝溶液滴在板上，若淀粉分解为葡萄糖，其降解产物将与紫碱蓝成蓝绿色，而未被淀粉酶降解的淀粉则呈紫色。
酶的测定方法
酶的测定方法
酶是一种生物大分子，能够催化生物化学反应。
酶的测定方法有多种，如下：
1. 活性测定法
酶的活性是指每单位时间内酶所催化的反应物的转化量。
通过活性测定法可以测定酶的活性，常用的方法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。
2. 蛋白含量测定法
酶是一种蛋白质，因此可以通过测定酶的蛋白含量来间接测定酶的含量。
常用的蛋白含量测定方法包括比色法、光度法等。
3. SDS-PAGE电泳法
该方法利用SDS-PAGE电泳将酶分离出来，然后通过染色等方法测定酶的含量。
4. 免疫学方法
该方法利用酶的抗原性质，通过抗体结合酶来测定酶的含量或活性。
常用的方法包括ELISA等。
总之，不同的酶测定方法适用于不同的酶以及不同的实验目的，选择合适的方法可以提高实验的准确性和可靠性。
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脱氢酶活性的测定（dehydrogenases）:脱氢酶活性的测定采用2-3-5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）为
底物经脱氢酶催化还原反应后生成红色产物TTCH2-trifenylformazane(TF)，TF颜色的深
浅可以反映脱氢酶活性的高低
[49]。
1. 配制TTC系列溶液
在7只容积为50 mL的容量瓶中分别加入0, 1，2，3，4，5，6 mL的l mg/mL 的TTC标准溶液，然后用去离子水定容至50 ml作为TTC系列溶液。
2. 标准曲线的绘制
在8支25 mL的具塞比色管中分别加入2 mL的pH 8.6的Tris-HCl缓冲溶液(三(羟甲基)氨基甲烷)、l mL的去离子水和TTC系列溶液，对照组无需加入TTC；然后向各管中各加入1 mL的10%的硫化钠溶液，将比色管振荡摇匀后置于暗处让溶液进行充分显色后，然后再向各管加入5 mL的丙酮溶液，在37 ℃水浴条件下进行10 min振荡萃取，然后3000 r/min条件下离心5 min，将上层有机溶液用723分光光度计进行测定吸光度值，光波波长492 nm 处，以试剂空白作为对照，根据吸光度值绘制标准曲线。
3. 测定步骤
取发酵液20 mL于研钵中，研磨完全后3000 r/min 条件下离心5 min，弃去上清液，
然后用蒸馏水补足，并搅拌洗涤三次，然后用蒸馏水补足，用玻璃棒搅匀后备用。
取活
性污泥制备液2 mL 于带塞比色管中，依次加入pH 8.6 的Tris-HCl 缓冲溶液、1.5 mL 的0.l mol/L 葡萄糖溶液、0.5 mL 的0.4% TTC 溶液和0.36%的Na2SO3溶液，在恒温水浴振荡仪（37±l℃）中培养2 h 后取出，再向比色管中加入0.5 mL 甲醛终止反应，向比色管中加入5 mL 丙酮，37±l ℃振荡萃取10 min，3000 r/min 的条件下离心5 min，取上清于492 nm 处测定吸光度。
在上述条件下，l h 产生1 μgTF 的量为一个酶活力单位。
辅酶F420的测定：采用分光光度法
[50]。
1.首先取发酵液泥水混合物20 mL，加入40 mL 的0.9%生理盐水，然后在6000 r/min
条件下离心15 min，弃去上清液，向沉淀中再加入40 mL 生理盐水使沉淀悬浮，在6000 r/min 条件下再离心15 min，同样弃去上清液。
向沉淀中再加入30 mL 的0.9%生理盐水使沉淀悬浮，然后在95～100 ℃水浴中保温20 min，不断搅拌污泥以使其受热均匀；
达到时间后取出冷却，记录下污泥体积值，以乙醇:污泥：水=2.5:1 的比例加无水乙醇，
搅拌混合均匀，然后6000 r/min 离心10 min 取上清液，将亮黄色上清液分为两份，分别测定溶液的吸光度。
一份用4 mol/L的NaOH溶液调节pH至13.5待测，另一份用6 mol/L 的HCl 调节pH<3.0 作为参比，在420 nm 波长下用分光光度计测量吸光度值，然后根据吸光度值进行计算。
2. 结果计算
C= (A1-A0)×f/ε×L，式中：C—辅酶F420浓度，单位mmol/L；A1—pH13.5 的待测样在420 nm 吸光度值；A0—参比样在420 nm 吸光度值；f—样品稀释倍数；L—比色皿厚度，单位cm；ε—辅酶F420的消光系数，单位L/(cm·mmol)，在pH=13.5时，ε=54.3 L/(cm·mmol)。
求出污泥混合液的辅酶F420的浓度C 后，可以根据污泥混合液的TS 浓度求出污泥内辅酶F420的浓度，计算公式为：CX=C/X，式中：CX 为单位质量污泥中酶F420的含量，mmol/g；X 为单位体积污泥中污泥的质量，g/L。
乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)
甲基辅酶M（特征性结构成分：2 一疏基乙烷磺酸）(Methy-coenzyme-M reductase, MCR）氢化酶(hydrogenase), 也称为氢酶。